[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒及制备方法

说明书

本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒的制备方法，选用的重组病毒颗粒rSFV‑Etgam59，并予以壳聚糖包裹，制备成的壳聚糖/rSFV‑Etgam59纳米粒，具有预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，减轻盲肠病变，降低卵囊排出量，减少免疫次数，安全性高的优势。

技术领域

本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/(rSFV-Etgam59)纳米粒的制备方法，该疫苗可用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，并且同时公开了纳米粒的制备方法以及抗柔嫩艾美耳球虫效果，属于基因工程技术领域。

背景技术

柔嫩艾美耳球虫（ Eimeria tenella）相比较于其他几种鸡球虫，是致病性最强的虫种。鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，可以导致体重下降，被毛凌乱等，严重时可以导致大批鸡只死亡。药物预防是目前生产实践环节控制球虫病最有效的措施，但是长期使用药物带来了球虫耐药性的出现，耐药性的出现迫使公司投入大量成本研发新药，长期以往陷入恶性循环当中。用疫苗免疫球虫病将成为球虫病防治的发展趋势，早期的球虫苗主要是活苗，分强毒苗和弱毒苗两种。它们在一定程度上解决了药物治疗的弊端，但不可否认，活苗也存在诸多缺陷，例如成本高、免疫途径受限、强毒苗致病、弱毒苗毒力返祖等缺点。研究人员期望能研制一种安全、简便、高效且成本低廉的疫苗来取代活苗。亚单位疫苗的出现给了鸡球虫病的预防提供了一种手段。亚单位疫苗是利用单抗和DNA重组技术生产出可产生保护作用的球虫蛋白质抗原，并制成疫苗进行免疫控制。但是亚单位疫苗的不足之处是免疫原性较低。

核酸疫苗不仅安全，高效，廉价和使用方便，而且还可以以其独特的诱发机体产生高水平的细胞免疫的能力，是控制鸡球虫病的一种重要手段。近年来，在DNA疫苗的基础上，更加发展出病毒颗粒疫苗。病毒颗粒这种疫苗形式，除了具备DNA疫苗的安全，高效，廉价和使用方便的优点外，还可以使其包装的DNA免受核酸酶的降解，增强抗原进入细胞的效率，充分发挥病毒样颗粒本身的免疫学特性。随着学者对免疫机制的不断研究,各种新型佐剂层出不穷,纳米佐剂的使用提高了生物利用度，使制剂的均匀性、分散性和吸收性也大大提高，是目前研究的热点。壳聚糖因为材料易得，来源丰富、在体内可生物降解、无毒副作用而研究最为深入，并且可以实现抗原的可控制释放，产生相当于常规疫苗多次接种激发的免疫效果，从而延长疫苗免疫期，减少免疫次数。

发明内容

本发明的目的是提供一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病。

本发明所述的一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒制备，技术解决方案如下：

制备壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒，首先包装出重组病毒颗粒rSFV-Etgam59。第一步首先构建出能正确传递和表达该基因的重组质粒pSMART2b-Etgam59，然后将重组质粒pSMART2b-Etgam59与辅助质粒pSHCAR共转染293T细胞，收取病毒原液并激活，在BHK-21细胞成功验证表达后，将激活的病毒颗粒用离子交联法制备壳聚糖纳米粒，包裹重组病毒颗粒。

本发明所述的一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）重组质粒pSMART2b-Etgam59的构建

设计引物PCR扩增柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因，序列如下：

F：CGCGGATCCGATGACTCGTCTCGCCGCCTG；

R：CCCATCGATTTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCCCA；