[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒及制备方法

权利要求书

1.一种壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）重组质粒pSMART2b-Etgam59的构建

设计引物PCR扩增柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因，序列如下：

F：CGCGGATCCGATGACTCGTCTCGCCGCCTG；

R：CCCATCGATTTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCCCA；

对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1×10⁴个孢子化卵囊，感染后132h杀取盲肠，用PBS清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的SAC溶液冲洗肠道，浸入SAC溶液中于37℃恒温摇床100rpm消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液；将收集的滤液3500rpm/min离心5min，用PBS冲洗两次；

配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入灭菌 PBS 液涡旋震荡，使其充分混匀；在含配子体的 PBS 液中加入30% Percoll，同时制备 PBS液与 Percoll 为 1∶1的分离液；在 10 mL灭菌离心管中，分别加入2mL分离液，5 m L含配子体和30% Percoll 的PBS液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用PBS液重悬、3200r/min、5min离心 ，用PBS洗涤4次，收集沉淀液氮保存；

提取配子体时期RNA并反转录为cDNA， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cDNA为模板，PCR扩增Etgam59，纯化后连接pMD18-T载体并保菌；测序正确后用无缝克隆的方法连接至pSMART2b的BamH1跟Cla1两个酶切位点，构建重组质粒pSMART2b-Etgam59；

提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，Opti-MEM 500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%-80%的293T细胞中，6h后换液，继续培养24-48h；裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行Western blot表达鉴定；

2）重组鸡球虫甲病毒颗粒制备

提取无内毒素质粒pSMART2b-Etgam59跟辅助质粒pSHCAR，二者按照1:1的量各1.5μg与lip2000 7μl共转染至293T细胞，6h后换液继续培养24-48h，之后收集病毒原液；

将收集的病毒原液激活：加入1/20体积α-糜蛋白酶10g/L以活化病毒，将p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白，室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶10g/L，室温孵育5min；紧接着将激活后的病毒感染BHk-21细胞2h，然后换液继续培养24-48h；

3）壳聚糖/rSFV-Etgam59纳米粒的制备

制备1%的壳聚糖醋酸溶液CS 0.5mg/ml，PH值调节至4.8；三聚磷酸钠溶液TPP 0.75mg/ml；将CS溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min；然后滴加TPP溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，纳米粒生成，然后继续搅拌20min。