[发明专利]一种多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的方法

说明书

本发明公开了一种多酶级联转化L‑酪氨酸生产酪醇的方法，属于生物工程技术领域。本发明所述的生产方法在将中间产物转化为酪醇的过程中利用一辅酶再生体系，通过将NADPsupgt;+/supgt;转化为NADPH，降低反应成本，提高整体转化效率。更进一步地，通过模块化组装和基因重复表达实现各酶的平衡表达，避免了中间产物的积累。并从反应的pH、温度对催化体系进行优化，可使得酪醇产量达到21.84g/L，转化率达到95.5％。从而大大降低了的底物成本和环境污染等问题，为酪醇的工业化生产和绿色生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

酪醇(2-(4-羟基苯基)乙醇)是一种天然酚类化合物，具有抗氧化和抗炎活性。该化合物的衍生物，如羟基酪醇和红景天苷，是重要的抗氧化剂和心血管药物，广泛应用于制药工业。此外，酪醇还可用作食品添加剂，以改善食品的风味，如清酒和葡萄酒。因此，酪醇作为一种重要精细化学品在医药和其他和工业领域中应用广泛，备受研究者的关注。

酪醇的生产方法主要包括植物提取、化学合成和微生物合成。酪醇存在于天然植物如橄榄和红景天中。然而，初榨橄榄油中酪醇的含量仅为40-180mg/kg oil。尽管天然资源丰富，但由于植物中的含量较低，且提取复杂，限制了酪醇的工业化生产。目前，酪醇的工业制备主要通过化学合成。酪醇可以通过一步或多步反应由前体如苯酚、苯乙醇、对羟基苯乙酸和对羟基苯胺生产。但是这类工艺方法存在原料成本高，工艺条件苛刻，纯化复杂；同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。

生物法合成酪醇具有成本低、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法包括微生物发酵法和细胞外酶转化法。近年来，已经报道了一系列关于酪醇在大肠杆菌和酿酒酵母中生物合成的研究。通过代谢工程改造酿酒酵母用于酪醇的生物合成，在摇瓶中可达927.68±25.26mg/L，在5L发酵罐中达到9.9g/L。以大肠杆菌为宿主，引入酪醇生物合成途径，从葡萄糖从头合成，酪醇产量在摇瓶中达到1508.7mg/L，在5L发酵罐中达到3.9g/L。

此外，目前采用多酶级联构建的全细胞催化简单前体生成高副加值产物已广泛应用。酶催化转化是一种高选择性反应，可达到定向转化的目的。Xue等人将来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10和转氨酶基因ARO8在大肠杆菌中共过表达，从1812mg/L酪氨酸中生产1203mg/L酪醇。此外，Mao等人共表达L-氨基酸脱氨酶(LAAD)、丙酮酸脱羧酶(ARO10)和苯乙醛还原酶(PAR)，可从0.9g/L L-酪氨酸合成0.65g/L酪醇。然而，这些方法由于酪醇产量低尚不能用于工业化生产。因此，开发一种高效生产酪醇的方法仍是一个挑战。

发明内容

[技术问题]

酪醇合成方法产量较低，且成本较高，不适于工业化生产。

[技术方案]

本发明提供了一种高效生产酪醇的方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌，实现了低价可再生底物L-酪氨酸到酪醇的高效生产。

本发明通过在大肠杆菌细胞中表达合成酪醇的路径酶：L-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶；通过引入葡萄糖脱氢酶-葡萄糖辅因子再生系统，将NADP⁺再生为NADPH，降低反应成本。随后通过模块化组装与基因重复表达平衡路径酶的表达，消除中间产物积累，进而实现了酪醇的高效生产，为酪醇的工业化生产奠定了基础(图1)。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产酪醇的重组大肠杆菌，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

在一种实施方式中，所述双质粒包括pETDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。