[发明专利]基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法

说明书

本发明提供基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，该方法包括：(1)提取样本的微生物基因组DNA；(2)将所述基因组DNA放入PCR反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行PCR扩增和熔解曲线测定，获得大肠杆菌O157:H7实时定量PCR的Ct值，根据标准对照液的Ct值和拷贝数拟合的标准曲线，即可定量检测大肠杆菌O157:H7。本发明稳定性良好、灵敏度高、特异性强，与土壤和粪便中的其他细菌无交叉反应，能够在1.5小时之内对土壤和畜禽粪便中大肠杆菌O157:H7进行定量检测。

技术领域

本发明属于大肠杆菌定量检测技术领域，具体涉及基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法。

背景技术

大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)是与食源性爆发相关的最常见的病原菌之一。植物生长的土壤是病原菌潜在的污染来源，粪便中存活的肠道病原菌在它们进入土壤环境后可进一步污染作物和河道，从而增加胃肠道疾病的潜在传播风险。大肠杆菌O157能够在施用粪肥的土壤中长期生存。据报道，大肠杆菌O157:H7在21℃条件下可在土壤中存活200天以上，最高可存活长达600天。即使是在含水量较低的土壤中，肠出血型大肠杆菌也能存活数月之久。一些大肠杆菌可以在河岸土壤以及河流底泥中生长，大肠杆菌O157:H7甚至可以吸收利用土壤中的可溶性物质。病原菌污染作物的潜力，与其在环境中的存活能力有直接的关系，如果病原菌能够存活至作物收获期，则可能通过被污染的作物传播到消费者体内。因此，应对粪便中残留病原菌在土壤中的存活时间和浓度、及其向地表和地下水资源迁移的风险给予充分的关注。

近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用，大肠杆菌O157:H7的检测方法也越来越多，但是这些方法大部分并不适用于微生物多样性非常高的土壤样品和粪便样品，而且检测时间也较长，定量检测难度较大。因此建立适用于土壤和粪便样品的，快速且灵敏的大肠杆菌O157:H7的定量检测方法十分重要，对畜禽粪肥在农业生态系统的合理施用，农业系统大肠杆菌O157:H7污染的预防及控制均具有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术中大肠杆菌O157:H7的检测效果不佳的缺陷，本发明提供基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，根据大肠杆菌O157:H7的β-葡萄糖醛酸酶基因组(β-glucuronidase gene)序列设计，特异性强，扩增大肠杆菌O157:H7的准确度高，稳定性好，可有效解决土壤和粪便中大肠杆菌O157:H7定量检测的问题。

作为本发明的一方面，本发明提供一种用于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其包括以下步骤，(1)提取样本的微生物基因组DNA；(2)将所述基因组DNA放入PCR反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行PCR扩增和熔解曲线测定，获得大肠杆菌O157:H7实时定量PCR的Ct值，根据标准对照液的Ct值和拷贝数拟合的标准曲线，即可定量检测大肠杆菌O157:H7，其中所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQID NO.2所示。

优选的，所述正向引物和所述反向引物的用量比为1:1。

优选的，所述进行PCR扩增，其反应条件为，预变性：95℃3min；变性：95℃20秒；退火：53-63℃30秒；延伸：72℃30秒，采集荧光信号；重复变性至延伸的步骤，总共40个循环。

优选的，所述熔解曲线测定，其为在所述延伸步骤后进行，测定条件为65℃升温至95℃，每隔0.5℃收集荧光信号。

优选的，最低检测DNA浓度为1.5×10^-4ng/μL。