[发明专利]基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法在审
| 申请号： | 202110291647.4 | 申请日： | 2021-03-18 |
| 公开（公告）号： | CN113201585A | 公开（公告）日： | 2021-08-03 |
| 发明（设计）人： | 彭双;王一明;宋丹;周贝贝;魏翠兰 | 申请（专利权）人： | 江苏开放大学（江苏城市职业学院） |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 曹翠珍 |
| 地址： | 210019 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 荧光 定量 pcr 技术 检测 大肠杆菌 o157 h7 方法 | ||
1.一种基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)提取样本的微生物基因组DNA；
(2)将所述基因组DNA放入PCR反应管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBRGreen Reaction Mix、ROX和无菌水，对标准对照液和待测样品同时进行PCR扩增和熔解曲线测定，获得大肠杆菌O157:H7实时定量PCR的Ct值，根据标准对照液的Ct值和拷贝数拟合的标准曲线，即可定量检测大肠杆菌O157:H7，其中所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：所述正向引物和所述反向引物的用量比为1:1。
3.如权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：所述进行PCR扩增，其反应条件为，
预变性：95℃3min；
变性：95℃20秒；
退火：53-63℃30秒；
延伸：72℃30秒，采集荧光信号；
重复变性至延伸的步骤，总共40个循环。
4.如权利要求3所述的基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：所述熔解曲线测定，其为在所述延伸步骤后进行，测定条件为65℃升温至95℃，每隔0.5℃收集荧光信号。
5.如权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：最低检测DNA浓度为1.5×10-4ng/μL。
6.如权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：土壤中最低检测拷贝数为2.03copies/μlDNA，0.33copies/ng DNA，920copies/g土壤。
7.如权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：步骤(2)中，获得标准对照液中的大肠杆菌O157:H7实时定量PCR的Ct值后，以拷贝数的对数为横坐标、Ct值为纵坐标，拟合标准曲线，将未知样品的Ct值带入标准曲线公式，即可获得待测样品的大肠杆菌O157:H7定量数据。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于江苏开放大学（江苏城市职业学院），未经江苏开放大学（江苏城市职业学院）许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202110291647.4/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
