[发明专利]一种新型冠状病毒检测方法

说明书

本发明涉及一种新型冠状病毒检测方法，所述检测方法包括抗体储备缓冲液的置换；磁珠的准备；抗体标记生物素biotin；标准品的配置；上机分析；该检测方法具有能在短时间内检测极低丰度值病毒特征性蛋白的优点，一小时内可分析96个样本(若采用全自动HD‑1机型通量可达288个)，同时样本上机分析均在封闭仪器中自动进行加样和处理，大大降低了试验人员与检测样本接触导致的感染风险。且该方法不仅能定性检测，更能精确定量检测，能够最大程度的提高新型冠状病毒感染的检测灵敏度，也能保证检测结果的可信度。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒检测方法。

背景技术

自2019年11月新型冠状肺炎(以下简称“新冠”)病毒被发现并被证实以来，给全球造成的疫情影响已不容乐观。迈入2021年，累计确诊该病病例已破亿数，检测防控形势仍是对全球疫情防控事业一个巨大的考验。目前作为最重要检测指标的核酸检测假阴性率过高，且存在一定数量的无症状患者(病毒的携带者)，漏检情况频发，导致了病毒的扩散和疫情的发展。因此，建立新的检测技术对降低检测的假阴性率意义重大。同时，在研发针对性的新冠病毒疫苗的同时，开发更高灵敏度的病毒检测技术，能更早更快的确定病毒感染携带风险，从而切断人群流动的传播途径，达到确切的预防和筛查新冠肺炎携带防控效力。

目前，通常采用荧光定量PCR检测法检测新冠病毒假阴性率达到40％，一方面是因为检材取样标准化不够，例如病毒还未扩散至下呼吸道时，而采用取口腔拭子的取样方法，会降低检测结果的不准确度，且取鼻拭子会伴有取样疼痛或不舒适感也会导致受试者排斥；另一方面，由于随着核酸提取和PCR的靶标片段损失，检出限也会随之降低。而目前基于抗体的检测方法(例如胶体金法)只能定性、不能定量，感染者可能由于免疫系统不活跃或耐受性的原因，没有产生足够的抗体，导致假阴性；而胶体金本身存在一定的假阳性率。

传统的ELISA反应中，抗原-抗体的反应体系通常在100μl，大量的荧光信号产生后被稀释在100μl的反应环境中，所以目前最大的问题是检测灵敏度不高，最高通常在皮克级别 (pg/ml)。

针对以上问题，发明人把目标放到检测新冠病毒的抗原，即新冠病毒本身上，增强检测方法的特异性和灵敏度。参照现有单分子免疫阵列(Single Molecule Arrays，SiMoA)技术平台进行开发，该方法操作较为简单，有极强的开放性和灵活性，仅需要能够特异性识别某种抗原的抗体对和待测抗原标准品并配置标准曲线，就能够检测样本里面的待测抗原，样本可以是血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液和细胞裂解液等。该技术使用和传统ELISA的原理，形成双抗夹心的免疫复合物，保证了反应的特异性。操作时需按照一定的包被条件将抗体对的其中一个包被到直径2.7μm磁珠的抗体结合位点上，另一个用生物素标记后加入进行孵育，孵育结束后加入亲和素偶联的酶和酶反应的底物，形成加入反应芯片的免疫复合物。每个芯片有238000个小孔，每个小孔的直径为4.2μm，刚好仅能落入一个磁珠，基于重力的作用磁珠掉入小孔后，系统会在芯片表面推一层油，一方面将多余的磁珠去除，最主要的还是将荧光信号锁住在小孔中(不易发生信号扩散和交叉反应)。这种情况下，酶分子催化底物产生的荧光分子就被锁在小孔反应体系中，含有目标抗原的磁珠因为带有酶而发出荧光，含有荧光的磁珠数目与落入整个芯片表面所有磁珠数目的比例与样本中目的抗原的浓度呈正相关，计算机便可准确计算出待测样品中目标抗原的浓度。

发明内容

本发明提供一种新型冠状病毒检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)抗体储备缓冲液置换为磁珠连接缓冲液；(2)磁珠的准备；(3)抗体标记生物素biotin；(4)标准品的配置；(5)上机分析。

所述(1)抗体储备缓冲液置换为磁珠连接缓冲液步骤为：

1)用超微量分光光度计分别测定MM05抗体和R001抗体的浓度，根据包被抗体要求的量100μg及测得的抗体浓度计算每个抗体需要的体积；