[发明专利]同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒及方法

权利要求书

1.一种同步检测植物油中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的免疫荧光层析试剂盒，包括检测卡、ID标曲芯片、提取试剂，所述检测卡包括底板，底板上从左至右依次衔接有吸收垫、反应膜、结合垫、样品垫，其特征在于，所述反应膜划有一条含有黄曲霉毒素B1偶联抗原检测线T1，一条玉米赤霉烯酮偶联抗原检测线T2，一条含有鸡IgY质控C线；所述的结合垫包被有黄曲霉毒素B1检测微球、玉米赤霉烯酮检测微球、羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球；

其中：

所述的黄曲霉毒素B1检测微球是连结有双长链-LC-LC加长臂的长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球结合制成的；

所述的玉米赤霉烯酮检测微球是连结有双长链-LC-LC加长臂的长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体与链霉亲和素荧光微球结合制成的；

所述的结合垫的制备方法为：将羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球，黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球按比例充分混合，用仪器均匀喷涂到玻璃纤维SB08上，45℃烘干备用；

所述的羊抗鸡IgY多克隆抗体标记微球制备方法如下：

(1)取1ml 0.05M MES缓冲液加入到2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；在上述离心管中加入4μl的浓度25mg/ml NHS和4μl的浓度25mg/ml EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

(2)将活化后的荧光微球离心分离，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl 0.02M pH8.0硼酸盐缓冲液，充分混匀；

(3)加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

(4)每管加入100μl 10％酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；再次离心分离，吸去上清液，保留沉淀，再加入1ml微球保存液，充分混匀，备用；

所述的黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球制备过程分为三个部分：

第一步：制备长链生物素化黄曲霉毒素B单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体

(1)取出长链生物素NHS-LC-LC-Biotin，室温平衡30min，用DMSO溶解至终浓度10mM备用；

(2)浓度均为2mg/ml黄曲霉毒素B1单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆抗体各取1ml至2个2ml离心管中，每管加入27μl步骤(1)配制的生物素NHS-LC-LC-Biotin，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

(3)反应完成后转移至超滤管中，12000g，离心15min，弃废液；

(4)向超滤管中加入2ml PBS缓冲液，12000g，离心15ml，弃废液；

(5)重复步骤(4)5次，200μl PBS复溶，收集标记抗体，BCA试剂盒测蛋白浓度；

第二步：制备链霉亲和素荧光微球

(1)取1ml标记缓冲液0.05M MES缓冲液加入到标记专用的2ml离心管，再加入荧光微球1mg，涡旋混匀；加入4μl25mg/ml的NHS和4μl25mg/ml的EDC，涡旋混匀，旋转培养器上反应20min；

(2)将活化后的荧光微球16500rpm离心20min，弃上清液，留取沉淀，加入1000μl0.02MpH8.0硼酸盐缓冲液，充分混匀；

(3)取100μμg链霉亲和素加入到步骤2)活化好的微球中，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应60min；

(4)封闭：每管加入100μl10％酪蛋白封闭液，涡旋混匀，超声完成后置于旋转培养器上封闭60min；完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

(5)加入1ml微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

(6)重复步骤(5)3次，充分去除未反应的链霉亲和素；加入1ml微球保存液，充分混匀，备用；

第三步：制备黄曲霉毒素B1检测微球和玉米赤霉烯酮检测微球

(1)分别取长链生物素化黄曲霉毒素B1单克隆抗体、长链生物素化玉米赤霉烯酮单克隆抗体各50μμg，加入2管均含1ml链霉亲和素荧光微球中，涡旋混匀，旋转培养器上反应30min；

(2)完成上述反应后，16500rpm离心20min，吸去上清液，留取沉淀；

(3)加入1ml微球保存液，充分混匀，16500rpm离心20min，吸去上清液；

(4)重复步骤(3)3次，充分去除未反应的生物素标记抗体；

(5)加入1ml微球保存液，充分混匀，备用。