[发明专利]一种高通量筛选ACE抑制肽的方法

说明书

本发明提供了一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，涉及生物肽的制备筛选技术领域。本发明所述方法包括如下步骤：1)蛋白水解物的制备；2)水解物的最佳筛选浓度确定；3)生物亲和超滤；4)肽组成高通量鉴定及以结合能为指标的分子对接二次筛选。本发明将生物亲和超滤结合高通量鉴定技术联用，极大提高筛选效率；所述方法基于小分子配体与酶相互作用的生物亲和性，最大化提升筛选的准确性。本发明所述方法在整个筛选过程中酶和样品的消耗量极大减少，并且以结合能为指标的分子对接模拟筛选可以预测肽的ACE抑制活性，分析肽和ACE的结合位点。本发明所述方法具有筛选效率高，耗时短且准确性高的优点，可广泛应用于ACE抑制肽的筛选。

技术领域

本发明属于生物肽的制备筛选技术领域，具体涉及一种高通量筛选ACE抑制肽的方法。

背景技术

高血压是以动脉收缩压或舒张压升高为特征的一种临床综合症，是导致心血管疾病(动脉硬化、中风和心肌梗塞)和终末期肾病的危险因素，在全球范围内，高血压以12.8％的死亡率高居榜首。血管紧张素转换酶在维持机体血压稳定发挥着重要的作用，它通过水解无活性的十肽AngⅠ成血管收缩活性物质AngⅡ和灭活缓激肽的双重功能，造成血压升高。抑制血管紧张素转换酶活性可有效降低血压，目前临床使用的血管紧张素转换酶抑制剂包括卡托普利、赖诺普利、西罗普利等，尽管这些药物具有明显的降压效果，但也会产生不同程度的副作用，如咳嗽、味觉功能紊乱、皮疹以及白细胞减少等。食源性ACE抑制肽的作用温和、无副作用，容易被机体吸收，且仅对高血压患者产生作用对正常人群血压无影响，这与化学合成类降压药形成了鲜明相比。

目前ACE抑制肽大多是通过水解蛋白获得，但蛋白质水解物的组成复杂，分子量分布也很广泛。从复杂蛋白水解物中筛选得到ACE抑制肽的步骤包括水解物的制备、以ACE抑制活性为导向的分离、纯化和肽序列的鉴定。而这些传统的分离和纯化过程既费时又费力。如何高效筛选得到高活性的ACE抑制肽成为亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，基于小分子配体与酶的相互作用的生物亲和性，通过超滤结合液相色谱-质谱联用技术实现ACE抑制肽的高通量筛选，以提升筛选效率和准确性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，包括以下步骤：(1)酶解蛋白后脱盐冻干，得蛋白水解物；

(2)将所述蛋白水解物配制成不同浓度的溶液后，测定ACE抑制活性，以ACE抑制率超过90％的水解物浓度为最佳浓度；

(3)将ACE与最佳浓度的蛋白水解物溶液共同孵育，在所述孵育后超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得多肽；

(4)对所述多肽进行高通量鉴定，选择和活性ACE结合的多肽进行分子对接模拟，按照结合能从小到大排列，合成结合能小的肽，合成比例为50％，得所述ACE抑制肽。

优选的，步骤(2)所述测定ACE抑制活性的方法包括：将活化的蛋白水解物溶液与活化的ACE溶液混合反应5min，再与活化的HHL溶液混合后反应1h，终止反应，利用HPLC法分析ACE抑制活性。

优选的，所述活化的蛋白水解物溶液、活化的ACE溶液和活化的HHL溶液的体积比为1：2：3；所述活化的ACE溶液中ACE的浓度为100mU/mL；所述活化的HHL溶液中HHL的浓度为2.5mmol/L。

优选的，所述活化包括分别将蛋白水解物溶液、ACE溶液和HHL溶液在37℃孵育1h。

优选的，所述HPLC法的条件包括：SB-C18分析型色谱柱；检测波长：228nm；流速0.8mL/min；流动相A：体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；流动相C：乙腈；进样量：5μL；洗脱条件：流动相C和流动相A的体积比为18:82；用超纯水做空白实验；