[发明专利]一种高通量筛选ACE抑制肽的方法

权利要求书

1.一种高通量筛选ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)酶解蛋白后脱盐冻干，得蛋白水解物；

(2)将所述蛋白水解物配制成不同浓度的溶液后，测定ACE抑制活性，以ACE抑制率超过90％的水解物浓度为最佳浓度；

(3)将ACE与最佳浓度的蛋白水解物溶液共同孵育，在所述孵育后超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收集洗脱液后干燥，得多肽；

(4)对所述多肽进行高通量鉴定，选择和活性ACE结合的多肽进行分子对接模拟，按照结合能从小到大排列，合成结合能小的肽，合成比例为50％，得所述ACE抑制肽。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述测定ACE抑制活性的方法包括：将活化的蛋白水解物溶液与活化的ACE溶液混合反应5min，再与活化的HHL溶液混合后反应1h，终止反应，利用HPLC法分析ACE抑制活性。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述活化的蛋白水解物溶液、活化的ACE溶液和活化的HHL溶液的体积比为1：2：3；所述活化的ACE溶液中ACE的浓度为100mU/mL；所述活化的HHL溶液中HHL的浓度为2.5mmol/L。

4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述活化包括分别将蛋白水解物溶液、ACE溶液和HHL溶液在37℃孵育1h。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述HPLC法的条件包括：SB-C18分析型色谱柱；检测波长：228nm；流速0.8mL/min；流动相A：体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；流动相C：乙腈；进样量：5μL；洗脱条件：流动相C和流动相A的体积比为18:82；用超纯水做空白实验；

ACE抑制率＝(空白对照的峰面积-样品的峰面积)/空白对照的峰面积×100％，式I。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1h。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述超滤离心时，以灭活的ACE做对照，包括：利用分子量为10kDa的超滤离心管，超滤离心3次，移除滤液后利用体积百分含量为70％的乙腈溶液重悬，再次孵育后离心，分别收集结合活性ACE和结合灭活ACE的两种多肽样品；

所述超滤离心和离心的转速均为4000rpm，时间均为20min。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述高通量鉴定的方法包括：

色谱条件为：色谱柱，AcclaimR PepMap RSLC；

流动相A：体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；

流动相B：体积百分含量为0.1％的甲酸乙腈溶液；

流速为220nL/min；

梯度洗脱条件包括：0～2min，4～12％流动相B；2～25min，12～22％流动相B；25～32min，22～32％流动相B；32～37min，32～75％流动相B；37～40min，75％流动相B；

采用正离子扫描模式，质谱数据采集通过Xcalibur 2.2 SP1软件操作，质量范围为250～1250m/z，分辨率为70000，根据一级质谱信号强度选择排名前20的多肽进行碎裂，碎裂模式为HCD，能量为27％；

母离子图谱用Xcalibur软件分析，同时采用PEAKS Studio 7.0软件进行De novo测序得到多肽氨基酸序列；

分别对比结合活性ACE和结合灭活ACE的两种样品的差异性，选择结合活性ACE的样品中特有的肽为具有潜在ACE抑制活性的肽。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述分子对接模拟的参数包括：

盒子中心坐标为：X＝40.607，Y＝32.451，Z＝43.579，盒子大小为：网格间距对接次数为100次，肽段中可旋转键不超过32个。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)得到所述ACE抑制肽后，还包括在体外测定所述ACE抑制肽的抑制活性。