[发明专利]一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用

权利要求书

1.一种心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其具体技术方案为：

（1）100 μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及流式细胞术检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础；

（2）100 μmol/l Hcy干预内皮细胞后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平；确定miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中发挥作用；

（3）转染miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor后，RT-qPCR检测miR-491-5p表达水平；确定转染miR-491-5p mimics、miR-491-5p inhibitor成功后，为反向验证miR-491-5p对 Hcy致内皮细胞凋亡的作用奠定基础；

（4）分别转染miR-491-5p mimics及miR-491-5p inhibitor，流式细胞术再次检测细胞凋亡情况，明确miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的作用。

2.根据权利要求1所述的心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其特征在于，所述检测miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的作用的步骤包括：①首先建立Hcy致内皮细胞凋亡的细胞模型；②RT-qPCR检测miR-491-5p在Hcy致内皮细胞凋亡中的表达；③转染miR-491-5p mimics与miR-491-5p inhibitor后，验证转染成功；④在转染miR-491-5p mimics与miR-491-5p inhibitor的基础上，再次检测细胞凋亡改变，明确miR-491-5p在内皮细胞损伤中的作用。

3.根据权利要求1所述的心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其特征在于，所述建立内皮细胞凋亡模型中，细胞培养方法为：用含 10% 胎牛血清DMEM 培养基培养HUVECs，置于37℃、5% CO2培养箱中，待细胞密度达 70% 左右时，用终浓度 0 μmol/L Hcy（0组）、100 μmol/L Hcy（Hcy组）干预细胞72h后，收集细胞用于后续实验。

4.根据权利要求1所述的心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其特征在于，细胞活力染色检测细胞凋亡情况为：弃去培养基，将激光共聚焦皿中的细胞用PBS清洗3次，在15ml离心管中加入5 ml PBS，5 μl Nuclei Dye、25 μl Dead Dye、3 μl Viable Dye，将三种染料混合后，在每个培养皿中依次加入200 μl混合染料，于37℃孵育30 min后取出，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。

5.权利要求1所述心血管疾病诊断用miRNA标志物及其应用，其特征在于，流式细胞术检测细胞凋亡情况为：使用不含 EDTA 的胰酶消化内皮细胞，800rpm、4 ℃ 离心弃上清；冷PBS 洗涤细胞 3 次后，用 400 μl× Annexin V 结合液重悬细胞，加入 5 μl Annexin V-FITC 染色液，轻轻混匀，4℃避光孵育 15 min，加入5 μl PI 染色液后混匀，避光孵育 5min，立即置于流式细胞仪检测细胞凋亡改变。