[发明专利]一种CAR-T细胞灌流培养方法

说明书

本发明提供了一种CAR‑T细胞灌流培养方法，其包括以下步骤：1）从受试者单采血细胞中分离获得外周血单个核细胞，然后从单个核细胞中分选获得T细胞；2）将分离的T细胞用CD3/CD28刺激磁珠进行激活处理；3）采用慢病毒载体感染激活后的T细胞；4）对慢病毒感染后的T细胞进行灌流培养，收获CAR‑T细胞；其中使用不含动物源成分的无血清培养基对CAR‑T细胞进行培养，所述不含动物源成分的无血清培养基的组成为：AIM‑V+(3~9)%ISR。该灌流培养方法能够在不显著降低培养效果的前提下，节省培养基，经济性更高。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种CAR-T细胞灌流培养方法。

背景技术

细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell ），全称为嵌合抗原受体T细胞，是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞通过直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。

使用CAR-T细胞治疗肿瘤的流程包括采集患者外周血、分离T细胞、将CAR导入T细胞、体外培养以及将细胞回输至患者。在体外培养过程中需要大量扩增CAR-T细胞，一般一个患者需要上亿，乃至几十亿个CAR-T细胞（体型越大，需要细胞越多），而CAR-T细胞扩增中所使用的培养基成本很高，对患者的经济负担过重。同时CAR-T细胞的存活率会直接影响CAR-T细胞对癌细胞的清除效率。临床研究证明，CAR-T细胞回输后在患者外周血中的增殖能力与疗效具有很强的相关性。另外，文献1（Almeida JR, Price DA, Papagno L, ArkoubZA, Sauce D, Bornsterin E et al. Superior control of HIV-1 replication by CD8+ T cells is reflected by their avidity, polyfunctionality, and clonalturnover. J Exp Med 2007;204: 2473-2485）和文献2（Harari A, Cellerai C, EndersFB, Kostler J, Codarri L, Tapia G et al. Skewed association of polyfunctionalantigen-specific CD8 T cell polpulations with HLA-B genptype. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104:16233-16238）均表明，T细胞分泌的细胞因子（例如IFN-γ）的含量与疗效密切相关。因此，如何在不显著降低培养效果的前提下，尽可能地节省培养基是亟待解决的问题。

文献3（Corey Smith et al., Ex vivo expansion of human T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement, Clinical Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31）公开了一种适用于基因修饰细胞（例如慢病毒介导的基因转导的T细胞）的无血清培养基，本发明在该文献的基础上对培养基及培养方法进行进一步的改进，以在不显著降低培养效果的前提下，尽可能地节省培养基。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提出一种CAR-T细胞灌流培养方法，该灌流培养方法能够在不显著降低培养效果的前提下，节省培养基，经济性更高。

基于上述目的，本发明提供了一种CAR-T细胞灌流培养方法，其包括以下步骤：