[发明专利]一种研究CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法在审
| 申请号： | 202110276969.1 | 申请日： | 2021-03-15 |
| 公开（公告）号： | CN113073119A | 公开（公告）日： | 2021-07-06 |
| 发明（设计）人： | 袁刚;曾传莉;朱德东;汪东辉;石小军;胡爱荣;胡耀仁 | 申请（专利权）人： | 中国科学院大学宁波华美医院 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/51;C12N15/113;C12N15/12 |
| 代理公司： | 杭州橙知果专利代理事务所(特殊普通合伙) 33261 | 代理人： | 杜放 |
| 地址： | 315010 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 研究 cxcr3 tlrs myd88 信号 通路 促进 乙肝 肝硬化 癌变 方法 | ||
1.一种研究CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，包括
步骤一：构建HBV过表达慢病毒载体；
步骤二：用HBV慢病毒感染LX-2细胞；
步骤三：从感染了慢病毒的LX-2细胞中提取出RNA和蛋白质，以进行PCR验证和WB验证；
步骤四：用CXCR3干扰剂转染HBV慢病毒感染的LX-2细胞，并从CXCR3干扰剂转染的LX-2细胞中提取出RNA和蛋白质，以进行qPCR验证和WB验证。
2.根据权利要求1所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述HBV过表达慢病毒载体的构建为，将HepatitisBvirus(GeneID:944566，479bp)构建到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro过表达慢病毒载体上。
3.根据权利要求2所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，所述步骤一中，HBV过表达PCR验证引物序列为HBV-F：TCTCAGCAATGTCAACGACC；
HBV-R：AATTTATGCCTACAGCCTCCT。
4.根据权利要求1所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，所述步骤二中，将慢HBV病毒和凝聚胺加入到LX-2细胞中，以感染细胞，并用嘌呤霉素筛选掉未感染HBV病毒的LX-2细胞，以获得稳定过表达HBV的LX-2细胞系。
5.根据权利要求1所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，所述步骤四中，感染慢病毒LX-2细胞的CXCR3干扰剂可以选择siRNA-F1，siRNA-F2，siRNA-F3。
6.根据权利要求5所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，所述CXCR3干扰剂优选siRNA-F3，所述siRNA-F3的序列为CUGGAGAACUUCAGCUCUUTT。
7.根据权利要求4所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，所述步骤二中，将感染了HBV慢病毒的LX-2细胞和未转染病毒的LX-2细胞中加入5ug/ml的嘌呤霉素，并在杀死所有未转染病毒的LX-2细胞之后，将嘌呤霉素的浓度降低至2ug/m，以获得稳定过表达HBV的LX-2细胞系。
8.根据权利要求1所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，还包括对用CXCR3干扰剂转染HBV慢病毒感染的LX-2细胞进行CCK8实验、细胞迁移实验以及细胞凋亡实验。
9.根据权利要求1所述的一种CXCR3介导的TLRs/MyD88信号通路在促进乙肝肝硬化癌变的方法，其特征在于，用ELISA检测正常人和肝癌肝硬化患者的血液，并对肝癌组织和癌旁组织进行Mason染色。
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