[发明专利]一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用

说明书

本发明公开了一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用，该方法包括如下步骤：S1，sgRNA文库设计；S2，制备CRISPR/Cas9载体文库；S3，遗传转化；S4，sgRNA鉴定；S5，检测基因编辑苗；本发明采用CRISPR/Cas9技术，一次性获得整个水稻多基因编辑突变体库，相比于现有的逐个基因敲除，效率提高，同时显著的减少工作量；同时本发明设计了一个完整、系统、高效的植物多基因组编辑和检测方法，可以高效、低成本的对大量通路基因或基因家族进行精准编辑和编辑苗的检测分析，为CRISPR/Cas9技术在植物信号通路研究或基因家族功能研究和筛选带来了帮助和参考意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是在多数细菌和古生菌中存在的一种获得性免疫系统，CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列与长度相似的间隔序列组成。Cas基因是一类由基因家族，编码的蛋白质具有与核酸结合的功能以及与核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合的活性，CRISPR/Cas9系统具有一系列的Cas基因，这些基因在宿主应对外源遗传物质入侵时发挥着不同的作用，而且在不同的物种中，Cas基因的种类也各不相同，具有丰富的多样性，会表达出多种同源但功能并不相关的Cas蛋白。CRISPR/Cas9技术作为第三代人工核酸内切酶技术，是Cas系统中最简单的，主要由编码Cas蛋白的基因、一个短的前导区以及一个由间隔序列和重复序列构成的CRISPR得基因座构成。前导区是由一段富含AT碱基的非编码序列构成，作为CRISPR启动基因发挥作用。虽然其作用机理现在还无法完全解释清楚，但是其作用过程可以分为三个阶段来理解，第一是CRISPR高度可变的间隔区的获得，第二是CRISPR基因座的表达，第三是CRISPR/Cas9系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。

创建不同动植物的突变体库，对于高通量的研究基因功能和创制种质资源十分重要。目前，基于CRISPR/Cas9技术已经在动植物中实现了高通量大规模的基因组编辑，可以实现对几万甚至十几万个基因位点进行定点的敲除，这可以高效的快速研究基因功能。但是，在创建植物突变库的过程中，在鉴定不同突变个体时，目前依然还是使用的是一代测序技术(Sanger测序)，成本极高，而且无法获得突变体的精准的突变类型。另一方面，为了研究某一类基因家族或相关的通路基因，需要对该基因家族和相关通路基因进行敲除，建立一个小型的突变体文库，但是目前少有相关的详细的技术资料。

因此，本发明拟开发一个完整的系统的构建水稻多基因突变体文库的方法，并且该方法可以高效低成本的获得大批量的基因编辑苗和检测基因编辑苗突变类型。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用。基于本发明中一种完整的系统的构建水稻多基因突变体文库的方法，实现了高效低成本的获得大批量的基因编辑苗和检测基因编辑苗突变类型的目的。

本发明的一个目的在于提供一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法。

所述构建水稻多基因编辑突变体库的方法，包括如下步骤：

S1，sgRNA文库设计：根据水稻基因组序列，针对水稻不同的功能基因设计特异性的sgRNA序列，然后加入一段与CRISPR/Cas9载体粘性末端互补的序列，制得sgRNA文库；

S2，制备CRISPR/Cas9载体文库：将步骤S1制得的sgRNA整合到CRISPR/Cas9载体上，送高通量测序验证构建正确后，形成CRISPR/Cas9载体文库；

S3，遗传转化：将步骤S2中制得的CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，经筛选鉴定、培养后得到菌悬液，然后将上述菌悬液转化水稻愈伤组织，经真核抗性筛选，获得转基因阳性植株；

S4，sgRNA鉴定：对步骤S3中获得的阳性苗进行载体骨架片段的测序分析，进行sgRNA鉴定，确定每株苗所对应的sgRNA种类；