[发明专利]一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用

权利要求书

1.一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，sgRNA文库设计：根据水稻基因组序列，针对水稻不同的功能基因设计特异性的sgRNA序列，然后加入一段与CRISPR/Cas9载体粘性末端互补的序列，制得sgRNA文库；

S2，制备CRISPR/Cas9载体文库：将步骤S1制得的sgRNA整合到CRISPR/Cas9载体上，送高通量测序验证构建正确后，形成CRISPR/Cas9载体文库；

S3，遗传转化：将步骤S2中制得的CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，经筛选鉴定、培养后得到菌悬液，然后将上述菌悬液转化水稻愈伤组织，经真核抗性筛选，获得转基因阳性植株；

S4，sgRNA鉴定：对步骤S3中获得的阳性苗进行载体骨架片段的测序分析，进行sgRNA鉴定，确定每株苗所对应的sgRNA种类；

S5，检测基因编辑苗：基于步骤S4中确定的阳性苗的sgRNA序列信息，批量化设计检测引物，对阳性苗进行PCR扩增和测序分析，最后获得详细的基因编辑类型和结果。

2.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S1中，所述sgRNA序列的GC含量在40～80％之间，靶标尽量处在第一外显子上，并与潜在脱靶位点至少存在3个碱基的区别，且不容许有4个连续T碱基；所述sgRNA序列两端加上与CRISPR/Cas9载体经BsaⅠ酶酶切后形成的4个碱基粘性末端互补的序列，加上互补序列后，

正向引物序列为：5’-TGCA-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，

反向引物序列：5’-AAAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，N代表任意碱基，且为设计的特异性sgRNA序列。

3.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S2中，所述CRISPR/Cas9载体文库构建过程中，采用的基因编辑载体为双元载体，所述双元载体包含有sgRNA表达框和Cas9表达框；并且所述CRISPR/Cas9载体文库中的每个质粒只表达1个sgRNA。

4.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S2中，首先采用BsaⅠ酶对所述CRISPR/Cas9载体进行酶切，然后与步骤S1中sgRNA文库混合，加入T4连接酶进行酶连，最后转化大肠杆菌，经抗性筛选鉴定、得到阳性克隆，将所述阳性克隆经过大量培养、质粒抽提等步骤，获得质粒文库。

5.如权利要求4所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，将所述质粒文库中的质粒，依据载体骨架序列，设计检测引物，所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，然后利用上述检测引物扩增包含sgRNA区间的序列，并且扩增产物大小控制在180～260bp之间；将上述扩增产物，送高通量测序，检测CRISPR/Cas9载体文库覆盖度。

6.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S3中，所述质粒载体转化农杆菌的方法为化学转化法或电击转化法，所述农杆菌菌悬液的浓度为OD₆₀₀：0.1～0.5。

7.如权利要求1所述的构建水稻多基因编辑突变体库的方法，其特征在于，步骤S4中，首先提取步骤S3中获得的阳性苗基因组，使用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，扩增包含sgRNA区间的序列，并且扩增产物大小控制在180～260bp之间；将上述扩增产物，送高通量测序，检测每株苗的sgRNA覆盖情况。