[发明专利]野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法

权利要求书

1.一种野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、取待测野化培训大熊猫的血液组织样本与圈养大熊猫组的血液组织样本，分离出外周血单核细胞；

B、提取总RNA,再将提取的RNA反转录为cDNA;

C、然后向cDNA中添加qPCR Mix、专用引物、去离子水配置成qPCR反应体系，qPCR反应使用荧光PCR操作平台；

D、使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平；

E、基于T检验获得圈养大熊猫组每个Marker基因的2^−∆∆Ct置信区间；

F、将待测野化培训大熊猫样本的每个Marker基因的2^−∆∆Ct值，与圈养大熊猫组对应的置信区间进行比较，若所有Marker基因的2^−∆∆Ct值大于置信区间的上限值，则认为免疫适应良好；

PCR扩增用到的专用引物：

Marker1：正向引物 5’-GTGCAAGGGGACAGACGAAC-3’

反向引物 5’-CTTGAGTGTTTGCAGCCTTGGA-3’；

Marker2：正向引物 5’-GATAGACCCACGACTGCACC-3’

反向引物 5’-GGTCTCGCCTCTTTCACAGG-3’；

Marker3：正向引物 5’-CTGGCTGTTGCTCTCTTGGC-3’

反向引物 5’-ATGGTTTCTGTTTCTCAGCCCTCTT-3’；

Marker4：正向引物 5’-GAAGGTAAAAGTCGGGCCTGG-3’

反向引物 5’-GGCAGTTTTCTGCAGCTACTGTATG-3’

Marker5：正向引物 5’-CTACGACACGTCCACCGACA-3’

反向引物 5’-CCAAAGCCGCTGTTCTGGATG-3’；

Marker6：正向引物 5’-CGAGTCACCTACCAGGGCTA-3’

反向引物 5’-TCCGTGAACTCTGACTCCGT-3’；

所述评估方法非疾病的诊断和诊疗目的。

2.根据权利要求1所述野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，实时荧光定量PCR扩增的内参基因的引物为：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

3.根据权利要求2所述野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，所述样本基因的2^−∆∆Ct的计算方法为：

D1、每个样本按步骤B和C进行三次，取三次Ct值的平均值，待测Marker基因Ct值的平均值-内参基因Ct值的平均值获得待测Marker基因表达量ΔCt；

D2、计算每个样品中待测Marker基因的2^−∆Ct值；

D3、计算圈养大熊猫组的2^−∆Ct的均值，用样本2^−∆Ct值/圈养组2^−∆Ct均值，得到每个样本待测Marker基因的2^−∆∆Ct值。