[发明专利]一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用

说明书

本发明提出了一种表达β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：S1、化学合成β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的基因序列；S2、酶切S1中所述基因序列并与酶切线性化的毕赤酵母表达载体分别连接或重组，得基因表达质粒；S3、将S2中构架好的基因表达质粒酶切线性化后分别或混合转化入毕赤酵母感受态细胞中；S4、通过His缺陷、G418抗性以及PCR方法筛选出分别或同时含有基因的阳性克隆菌株，得到能够分别或同时表达β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母；所述β‑甘露聚糖酶以及α‑半乳糖苷酶的核苷酸序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。本发明通过β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶配合使用可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖。

技术领域

本发明涉及一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用。

背景技术

半乳甘露聚糖是一种包含了甘露糖骨干与半乳糖旁基的多糖，是一种抗营养因子，其抗营养作用的主要原因是溶于水后具有的高度粘性。由于动物体内不能产生降解半乳甘露聚糖的酶类，动物采食半乳甘露聚糖含量高的食物后，增加了肠道食糜的粘度，降低了胃肠道运动对食糜的混合效率，从而阻碍酶对饲料的消化和养分的吸收。

现有技术通过单一的酶如β-甘露聚糖酶消除抗营养因子半乳甘露聚糖，但是，β-甘露聚糖酶只能水解甘露糖骨干的1,4连接键，不能水解1,6键连接的半乳糖残基，水解产物很大一部分不是单糖或寡糖。营养物质不能充分被吸收利用造成了食物的浪费，也使得动物觅食后长不快。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用，β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用既可以水解甘露糖骨干的1,4连接键，又能水解1,6键连接的半乳糖残基，水解产物是单糖或寡糖，可以被动物充分吸收利用。β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用作为饲料添加剂可以加快动物生长。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：

S1、化学合成如SEQ ID No.1所示的β-甘露聚糖酶和如SEQ ID No.2所示的α-半乳糖苷酶的基因序列；

S2、酶切S1中所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列并与酶切线性化的毕赤酵母表达载体分别连接或重组，得β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒；

S3、将S2中构建好的β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒酶切线性化后分别或混合转化入毕赤酵母感受态细胞中；

S4、通过His缺陷和G418抗性筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出分别或同时含有β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因的阳性克隆菌株，得到能够分别或同时表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母；

所述β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。

进一步地，所述S2中β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列与酶切线性化的毕赤酵母表达载体通过T4连接酶或2X ClonExpress Mix连接或重组。

进一步地，所述S3中表达质粒采用Sacl酶切线性化。

进一步地，所述表达质粒线性化后跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。

进一步地，将完全线性化的所述表达质粒等量或等比例混合后，转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-240rpm条件下进行摇床培养1h。