[发明专利]一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、化学合成如SEQ ID No.1所示的β-甘露聚糖酶和如SEQ ID No.2所示的α-半乳糖苷酶的基因序列；

S2、酶切S1中所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列并与酶切线性化的毕赤酵母表达载体分别连接或重组，得β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒；

S3、将S2中构建好的β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒酶切线性化后分别或混合转化入毕赤酵母感受态细胞中；

S4、通过His缺陷和G418抗性筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出分别或同时含有β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因的阳性克隆菌株，得到能够分别或同时表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母；

所述β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。

2.根据权利要求1所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S2中β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列与酶切线性化的毕赤酵母表达载体通过T4连接酶或2X ClonExpress Mix连接或重组。

3.根据权利要求1所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S3中表达质粒采用Sacl酶切线性化。

4.根据权利要求3所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述表达质粒线性化后跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。

5.根据权利要求4所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，将完全线性化的所述表达质粒等量或等比例混合后，转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-240 rpm条件下进行摇床培养1h。

6.根据权利要求1所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S4中PCR监测过程中，依据所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶所示的检测引物对初步筛选所得的毕赤酵母菌进行检测，挑选出同时整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株。

7.根据权利要求6所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，将所述同时整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株跑SDS-PAGE胶鉴定分泌蛋白，挑选得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因表达量高的菌株。

8.基于权利要求1-7所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，获取一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母中包含β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的基因序列。

9.根据权利要求8所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母表达质粒包括载体pPIC9K和EcoRI酶切位点与Not1酶切位点之间的全长基因如β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因。

10.一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，包括如下步骤：

将毕赤酵母工程菌株转接入含有15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28-30℃，200-240 rpm条件下进行摇床培养至OD600=2-6；

菌体重悬于BMM培养基，200-240 rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5%甲醇诱导，培养4-6天；

c、应用：将β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶作为饲料添加剂应用于降解饲料中的抗营养因子半乳甘露聚糖。