[发明专利]α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用

说明书

本发明提供α‑酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，所述α‑酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本发明还提供一种催化合成青蒿素中过氧桥键的方法，可通过α‑酮戊二酸依赖型双加氧酶催化得到。本发明对于青蒿素的规模化生产，以及含有环内过氧桥键化合物的合成具有重要意义。

技术领域

本发明涉及α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，涉及分子生物学技术领域。

背景技术

环内过氧化合物是指环内包括过氧桥键的化合物，其具有多种生物活性，随着越来越多环内过氧化合物的应用，使得环内过氧化合物的体外催化合成成为了新的研究方向，其中，环内过氧化合物的合成难点之一就是环和过氧桥键的催化合成。

例如，青蒿素是一种具有环内过氧桥键的倍半萜的化合物，青蒿素的抗疟疾活性与“过氧桥键”密不可分。青蒿素的主要来源为植物提取，但是野生型青蒿中青蒿素含量仅占干重0.1％-1％，因此，研发青蒿素的体外合成方法就十分重要，而体外合成青蒿素的难点就在于环内过氧桥键的合成。

发明内容

本发明提供α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用和一种催化合成青蒿素中过氧桥键的方法。

本发明第一方面提供了α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了与α-酮戊二酸依赖型双加氧酶同源性在70％以上的酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

本发明第三方面提供了α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成青蒿素环内过氧桥键中的应用，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，编码所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因具有如SEQIDNO.2所示的序列。

进一步地，在催化合成过程中，还需加入维生素C、MgCl₂、NADPH、DTT和青蒿酸。

进一步地，所述催化合成过程具体包括如下步骤：

在100mM PBS缓冲液中，加入100μgα-酮戊二酸依赖型双加氧酶、10mM维生素C、10mM MgCl₂、200nM NADPH、0.1mM DTT、200μM青蒿酸，在30℃下避光反应24小时，得到青蒿素。

本发明第四方面提供了一种α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的制备方法，包括如下步骤：

提取青蒿总RNA，并以所述总RNA为模板合成得到cDNA；

从所述cDNA中提取得到如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；

将所述核苷酸序列导入表达载体pET30a中，构建得到重组载体；

将所述重组载体导入大肠杆菌中进行表达，得到所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶。

进一步地，将所述重组载体导入大肠杆菌中进行表达，具体包括：

将导入重组载体后的大肠杆菌在37℃下培养至OD600为0.6，加入0.5mM IPTG，在16℃下继续培养12h，培养结束后，收集菌体，加入裂解液并纯化得到所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶。

本发明第五方面提供了一种催化合成青蒿素中过氧桥键的方法，通过α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化得到，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述方法包括如下步骤：