[发明专利]α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用

权利要求书

1.α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，其特征在于，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.与α-酮戊二酸依赖型双加氧酶同源性在70％以上的酶在催化合成环内过氧桥键中的应用，其特征在于，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成青蒿素环内过氧桥键中的应用，其特征在于，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的基因具有如SEQ ID NO.2所示的序列。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，在催化合成过程中，还需加入维生素C、MgCl₂、NADPH、DTT和青蒿酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化合成过程具体包括如下步骤：

在100mM PBS缓冲液中，加入100μgα-酮戊二酸依赖型双加氧酶、10mM维生素C、10mMMgCl₂、200nM NADPH、0.1mM DTT、200μM青蒿酸，在30℃下避光反应24小时，得到青蒿素。

7.一种α-酮戊二酸依赖型双加氧酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取青蒿总RNA，并以所述总RNA为模板合成得到cDNA；

从所述cDNA中提取得到如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

将所述核苷酸序列导入表达载体pET30a中，构建得到重组载体；

将所述重组载体导入大肠杆菌中进行表达，得到所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述重组载体导入大肠杆菌中进行表达，具体包括：

将导入重组载体后的大肠杆菌在37℃下培养至OD600为0.6，加入0.5mM IPTG，在16℃下继续培养12h，培养结束后，收集菌体，加入裂解液并纯化得到所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶。

9.一种催化合成青蒿素中过氧桥键的方法，其特征在于，通过α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化得到，所述α-酮戊二酸依赖型双加氧酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

在100mM PBS缓冲液中，加入100μgα-酮戊二酸依赖型双加氧酶、10mM维生素C、10mMMgCl₂、200nM NADPH、0.1mM DTT、200μM青蒿酸，在30℃下避光反应24小时，得到青蒿素。