[发明专利]一种氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法和应用

说明书

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地涉及一种直接识别氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法和应用，本发明提出一种通用的氨基甲酸酯类农药半抗原设计路线，分别将半抗原和分别偶联到载体蛋白上，分别成功制备得到人工抗原。利用其中人工抗原用于免疫动物，制备能分泌抗氨基甲酸酯类农药抗体的杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞培养，进而使用单克隆制备抗体；利用人工抗原作为包被原，进一步建立一种基于间接竞争酶联免疫法的氨基甲酸酯类农药的检测方法，本检测方法检测氨基甲酸酯类农药农药残留具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，检测的IC50值为7.13ng/mL，检测限为(IC10)1.7ng/mL，线性检测范围为2.9～17.9ng/mL。

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，更具体地涉及一种直接识别氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法和应用。

背景技术

我国是农业大国，每年在农业产生中消耗大量农药，残留的农药易造成环境污染和食物急性中毒等严重问题。氨基甲酸酯类农药属于有机磷类农药，是目前广泛使用的杀虫剂之一。针对氨基甲酸酯类农药检测，目前仪器分析法是主要的分析方法，但仪器分析法需要昂贵的仪器、专人操作与维护、复杂前处理，并且无法实现现场快速检测。为弥补仪器分析法缺点，有必要开发出一种可以实现快速高通量筛查的分析方法，用于现场快速检测。

免疫分析法是基于抗原与抗体特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体结构、静电、氢键和范德华力等的综合作用，具有任何一种单独理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，因此具有灵敏度与常规的仪器分析一致、适合现场筛选、简单、快速、成本低、样品所需量少等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的快速检测技术。世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术。美国化学学会(ACS)将免疫分析技术、色谱分析技术共同列为农药、兽药和渔药残留分析的主要技术。

半抗原设计是针对小分子免疫分析法的核心基础，目前尚无一种针对氨基甲酸酯类农药的通用半抗原所设计。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用的氨基甲酸酯类农药半抗原设计路线以及相应的抗体制备方法和应用，以提高研发效率和降低研发成本。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法，包括半抗原的制备方法和完全抗原的制备方法，所述半抗原的制备方法包括下列步骤：见反应式(I)和(II)：

反应式(I)和(II)中的R为氨基甲酸酯类农药特征基团；所述完全抗原的制备方法的制备的完全抗原(III)和(IV)，其结构式为

1)氨基甲酸酯类农药原料(R-OH)与对硝基酰氯溶解于二氯甲烷(DCM)和三乙胺(Et3N)，持续搅拌反应生成溶解于乙酸乙酯，然后用0.5M盐酸溶液，弃去水层，乙酸乙酯层蒸发干燥，得到纯净的

2)溶解于1，4-二氧六环，冰浴下滴加溶解在20mL饱和碳酸氢钠的氨基己酸，过滤后用盐酸调节pH至4-5，然后用乙酸乙酯萃取水层三次，乙酸乙酯蒸发干燥后得到粗产物，使用400目硅胶柱对粗产物纯化，初始流动相为乙酸乙酯：甲醇＝10：1，待对硝基苯酚等副产物完全流出后，用甲醇冲洗硅胶柱，将产物完全洗脱，于-20℃冷冻过夜后得到白色晶体状的半抗原

3)氨基甲酸酯类农药原料(R-OH)溶解于DMF中，加入碳酸钾和2-溴乙酸乙酯或4-溴丁酸乙酯，在70℃中搅拌回流反应5h后加入乙酸乙酯和三级水萃取，移除水层；

4)乙酸乙酯层旋转蒸发后得中间产物，向中间产物加入氢氧化锂溶液，搅拌1h，然后加入乙酸乙酯萃取未水解完毕的中间体，弃乙酸乙酯层，萃取完毕后，用盐酸将水层pH调节至4-5，产物析出，有机相干燥后在石油醚中重结晶出半抗原