[发明专利]一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法

说明书

本发明公开了一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法。本发明利用优化的内生菌高效提取技术，把根表微生物去除彻底，结合宏基因组‑单菌草图组装技术，去除植物宿主质体和线粒体的干扰，获得纯根内生菌的菌群信息，再进一步对根内生菌群落功能及其功能基因进行鉴定。本发明方法通过内生菌高效提取技术，能够把根表微生物去除彻底，大大降低了根表微生物残留对判断根内生菌群功能的影响；另外，把根内生菌DNA提取后，利用宏基因组‑单菌草图组装技术，可以在不明确植物宿主基因序列的情况下，对植物宿主质体和线粒体进行直接去除。本发明方法可以避开根系中根际、根表等微生物的干扰，直接了解植物根内生菌群落功能及其功能基因。

技术领域

本发明属于微生物生态学领域，具体涉及一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法。

背景技术

植物内生菌具有重要的环境生态和植物生理作用。有研究表明，根内微生物可以促进宿主植物体的生长，增强宿主植物对病原体、养分缺乏、金属污染等胁迫的抗逆性，在环境污染治理和生态农业领域中的巨大应用潜力。

虽然近些年在植物根部内生菌的生态和生理作用方面展开了一系列的研究，但还有许多问题需要进一步探讨。例如，由于绝大多数微生物无法通过纯培养技术获得，大量的内生菌仍然未被发现，植物根部内生菌的作用机理仍然不清，内生菌对植物根部的相互作用有待深入认识等。

目前，学界也不断发展基于不同分子生物学技术的非培养研究，而各种非培养研究的基础就是提取高质量的基因组DNA，以及排除植物宿主本身的质体和线粒体的干扰。因此，需要一种能去除植物根表微生物及植物宿主干扰的研究方法，来帮助深入了解植物根部内生菌对污染物(例如砷)的抗性及代谢作用机制。

发明内容

现有技术由于很难排除植物宿主本身的质体和线粒体干扰，因此少有对植物根内生菌群落功能及其功能基因的鉴定研究。为了克服这个技术缺陷，本发明利用优化的内生菌高效提取技术，把根表微生物去除彻底，结合宏基因组-单菌草图组装技术，去除植物宿主质体和线粒体的干扰，获得纯根内生菌的菌群信息，再进一步对根内生菌群落功能及其功能基因进行鉴定。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法，包括以下步骤：

(1)去除植物根表杂菌

抖落植物根表附着土，将植物根依次置于MgSO₄溶液、含有Tween 20的MgSO₄溶液、MgSO₄溶液、含有Tween 20的次氯酸钠溶液、MgSO₄溶液中旋涡震荡或超声处理，去除植物根表杂菌；

MgSO₄极容易吸收水分，利用MgSO₄能使细菌脱水，从而达到杀菌的目的。此外，MgSO₄还是一种强氧化剂，可以进一步破坏细菌的细胞结构。旋涡震荡或超声处理目的是使缓冲液和植物根部充分接触，除菌更彻底。

步骤(1)和(2)所述的MgSO₄溶液优选浓度为10mM；

步骤(1)所述含有Tween 20的MgSO₄溶液，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)；

步骤(1)所述含有Tween 20的次氯酸钠溶液，次氯酸钠浓度为1％(v/v)，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)；

(2)分离内生菌并提取总DNA

将去除根表杂菌的植物根在MgSO₄溶液中破壁匀浆，滤布过滤取滤汁；滤汁在500×g下离心10min，将上清液再于9500rpm下离心15min，利用离心形成重量差，重量较大的细菌细胞会沉到底部，保留菌体细胞沉淀物；