[发明专利]一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法

权利要求书

1.一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)去除植物根表杂菌

抖落植物根表附着土，将植物根依次置于MgSO₄溶液、含有Tween 20的MgSO₄溶液、MgSO₄溶液、含有Tween 20的次氯酸钠溶液、MgSO₄溶液中旋涡震荡或超声处理，去除植物根表杂菌；

(2)分离内生菌并提取总DNA

将去除根表杂菌的植物根在MgSO₄溶液中破壁匀浆，滤布过滤取滤汁；滤汁在500×g下离心10min，将上清液再于9500rpm下离心15min，保留菌体细胞沉淀物；

将菌体细胞沉淀物重悬于无菌NaCl溶液中，再缓慢加入到碘海醇溶液上方，然后于15000×g下离心60min，回收乳白色条带部分；随后去除回收部分的碘海醇，加入等体积的无菌NaCl溶液，在7500×g下离心20min，去除上清液后加入无菌NaCl溶液重新悬浮；最后于7500×g下离心20min，取沉淀，加入无菌NaCl溶液重悬，即为回收的内生菌，提取内生菌总DNA；

(3)内生菌宏基因组DNA测序及分析

3.1、建立根内生菌的DNA宏基因组文库，获得原始测序Reads；利用Trimmomatic-0.36进行测序数据质控，过滤低质量数据；进行序列拼接，得到Contigs；进行序列比对，把Contigs的独立数据集的Reads进行映射用来评估其丰度；利用KEGG数据库对Contigs进行序列物种注释；利用Blobtools进行可视化，根据序列种属、GC比以及覆盖度，结合Bowtie评估的丰度，对原始序列进行过滤，去除植物宿主序列；对Contigs使用默认设置的CONCOCT、Metabat2、Maxbin2进行组装，并利用Metawrap对所得的MAG进行提纯，得到高质量的宏基因组拼接基因组(MAGs)；

3.2、取完整度50％和冗余度10％的MAGs进行下游分析，分析这些MAGs所属的门类，基于Ghostkoala比对KEGG数据库中污染物代谢相关功能基因，若MAG序列中具有与数据库高度相似的基因序列，则认为MAG中具有该功能基因，检测这些MAG中是否含有相同的碳氮硫代谢的相关功能基因序列；

利用blastp比对抗生素及金属抗性功能数据库，对比分析MAGs所含的植物促生基因与污染物代谢相关功能基因序列；

利用Salmon工具将所得到的MAG在宏基因组中对各个基因拷贝数进行定量，通过MAGs中各功能基因拷贝数判断植物根部内生菌参与关键物质循环的强度，所含碳氮硫等典型关键元素代谢的基因拷贝数越大，证明所参与的关键营养元素循环作用越重要，污染物抗性及代谢基因拷贝数越大，则对污染物抗性表现越强、利用污染物参与自身代谢的作用越强。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)和(2)所述的MgSO₄溶液，浓度为10mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述含有Tween 20的MgSO₄溶液，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述含有Tween 20的次氯酸钠溶液，次氯酸钠浓度为1％(v/v)，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述滤布的孔径为25μm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述无菌NaCl溶液的浓度为0.8％(W/V)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述碘海醇溶液的浓度为1.3g/ml。