[发明专利]一种杂交枫香遗传转化的方法

说明书

本发明公开了一种杂交枫香胚性愈伤组织的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。本发明方法包括：采用农杆菌对杂交枫香愈伤组织进行浸染处理，然后将浸染处理后的愈伤组织接种于筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选培养。通过对抗性愈伤组织的PCR阳性鉴定，利用本发明的遗传转化方法可在短时间内获得大量阳性抗性愈伤，即通过利用农杆菌介导法，建立杂交枫香高效遗传转化体系，本发明方法枫香遗传转化效率高，对于培育枫香新品种和基因功能验证具有重要意义。

技术领域

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以胚性愈伤组织为受体材料，根癌农杆菌介导的杂交枫香遗传转化方法。

背景技术

枫香属(Liquidambar L.)植物为金缕梅科枫香亚科的高大落叶乔木，具有极高的观赏价值、使用价值和生态价值。常绿阔叶树种多数在秋季叶片变黄，逐渐凋落，而枫香在秋季经历较大的昼夜温差后，叶片逐渐转变为红色，是优良的观赏树木，唐朝诗人杜牧即有“停车坐爱枫林晚，霜叶红于二月花”的赞叹。同时，枫香树形优美，木材坚硬，作建筑用材有“梁阁千年枫”之说，是制造家具、胶合板和包装材料的理想用材。此外，枫香树有较为突出的生态价值，其涵养水源能力强，落叶量大，能优化土壤结构，改善林地生境。其中，以中国枫香为父本，北美枫香为母本进行控制授粉所获得的杂交枫香在生长性状方面表现出明显的杂种优势。

遗传转化是指同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。根据感受态建立方式，可以分为自然遗传转化(natural genetic transformation)和人工转化(artificialtransformation)，前者感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。

目前枫香属植物转基因研究普遍以叶片为受体材料的农杆菌介导的遗传转化方法，例如许林、刘冉冉、雷莎等人对枫香叶片进行预培养3d后，使用OD₆₀₀为0.5的农杆菌菌液对其进行侵染，侵染10min，25℃共培养4d后进行筛选培养，初步获得21株阳性转化苗；又如乔桂荣等人使用OD₆₀₀为0.5的农杆菌菌液对枫香叶片进行侵染，侵染8～10min，25℃共培养3d后进行筛选培养，成功获得转基因植株；Sullivan和Lagrimini(1993)利用含有gus：nptII的农杆菌对北美枫香叶片进行侵染，侵染7min，28℃共培养3d，成功获得转基因植株。上述方法虽然获得了转基因植株，但是使用叶片进行遗传转化，转化效率低，且易产生嵌合体，而且器官发生培养程序复杂，培养周期长。

本发明方法基于高效的杂交枫香体细胞胚胎发生体系，使用胚性愈伤组织进行遗传转化，一方面，愈伤组织分化程度低，显著减少嵌合体发生，是优良的受体材料；另一方面，体胚发生所需时间短，通过体细胞胚胎发生途径中获得高密度、高质量的体胚苗，比器官发生效率更高，大大缩短育种周期，加速功能验证的进程。

目前国内尚未有杂交枫香胚性愈伤组织遗传转化方面的研究，对进行杂交枫香遗传改良和基因功能研究造成了巨大障碍。

发明内容

本发明的目的是针对现有枫香属植物遗传转化中存在培养程序复杂、培养周期长等技术不足，提供了一种杂交枫香胚性愈伤组织遗传转化的方法，通过采用根癌农杆菌介导的遗传转化法对胚性愈伤组织进行遗传转化，为杂交枫香的遗传转化、品质改良和基因功能验证提供了一个新途径。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种杂交枫香胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括采用农杆菌对杂交枫香愈伤组织进行浸染处理，然后将浸染处理后的愈伤组织接种于筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选培养。

其中，所述农杆菌选用EHA105农杆菌。