[发明专利]一种细菌耐氯性的快速评价方法

说明书

本发明公开了一种细菌耐氯性的快速评价方法，先对细菌进行驯养，利用流式细胞仪对驯养后的菌液进行计数，制备适宜菌细胞浓度的污染样品，然后进行氯消毒试验，流式细胞术进行消毒后菌细胞活性的检测，最终计算细菌氯耐受指数值并根据耐氯性评价规则实现对细菌耐氯性的评价。本发明将细菌划分为活细胞、受损细胞、死细胞三个群体进行计数，充分考虑了活的不可培养状态细胞可能带来的风险；同时引入氯耐受指数概念及计算方法，更加全面的量化评估了细菌的耐氯能力，大大缩短了耐氯性评价的时间。

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及细菌耐氯性的快速评价方法，尤其是基于流式细胞术的供水系统中细菌耐氯性评价方法。

背景技术

氯作为一种消毒技术在供水系统中被广泛应用，氯消毒过程也是对细菌耐氯性选择的过程，供水系统中部分细菌对氯消毒剂产生了抗性后能够在含有较高余氯浓度的自来水厂、管网系统中存活，这部分细菌被称为“耐氯性细菌”或“耐氯菌”。

供水系统中耐氯菌的存在是研究者们一直关注的问题，水源、管网等均有耐氯菌检出的报道。供水系统中耐氯菌的存在可引起多方面的危害：(1)部分耐氯菌为致病菌或者条件致病菌；(2)细菌氯耐受性与抗生素耐药性之间存在相关性；(3)配水系统中的耐氯菌会导致管道腐蚀和生物膜过度生长；(4)耐氯菌的过度繁殖导致膜工艺处理系统效率降低、能耗增加和结构部件使用寿命缩短等问题。

目前，耐氯菌通常被定义为具有高抗氯消毒能力的细菌或能在余氯中存活甚至再生的细菌，是一个相对的概念。耐氯菌的科学定义和抗氯能力的量化方法至今为止未达成共识。WHO于2011年提出了一种评估病原微生物耐氯性的方法，该方法基于微生物在常规消毒剂量(0.5mg/L游离氯)下的存活时间。专利“一种细菌耐氯性的评估方法”(ZL201811024489.0)提出了以消毒剂浓度和反应时间的乘积(CT值，mg·min/L)为指标进行耐氯性评估的方法。也有研究提出以对数灭活率作为评价细菌耐氯性的指标，这些方法均采用培养法进行耐氯性细菌的培养，存在以下两方面的问题：(1)多采用低温、贫营养培养条件，耗时较长；(2)消毒过程中存在大量活的不可培养(VBNC)状态的细菌，传统培养法无法对其进行检测，往往忽略了该部分受损菌体可能带来的危害。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种细菌耐氯性的快速评价方法，为供水系统中耐氯性细菌的筛查及耐氯性的量化评估提供支撑。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明先对细菌进行驯养，利用流式细胞仪对驯养后的菌液进行计数，制备适宜菌细胞浓度的污染样品，然后进行氯消毒试验，流式细胞术进行消毒后菌细胞活性的检测，最终计算细菌氯耐受指数值并根据耐氯性评价规则实现对细菌耐氯性的评价。

(1)菌的驯养：将冻存管中保存的菌液加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，对冻存的菌株进行复苏；以菌株原生长环境水体作为细菌驯养基质液，对待评价菌株进行驯养，得到驯养的菌液；若原生长环境水体难以获得，以无菌磷酸盐PBS缓冲液作为替代驯养基质液；

(2)氯消毒试验：步骤(1)驯养的菌液经离心收集菌细胞，使用稀释基质制备成菌悬液，流式细胞仪上机分析计数，根据计数结果稀释制备消毒用工作菌液，加入氯消毒剂进行消毒试验，试验结束加入足量反应终止剂至去除残留余氯；

(3)菌细胞浓度计算：步骤(2)终止反应后，使用流式细胞仪进行消毒后菌液细胞活性的检测，按照活性将菌细胞分为活体菌、死亡菌以及受损菌三个群体，按照公式(1)计算消毒后菌细胞浓度：

N＝C_L+C_I×50％ (公式1)

式中：N-消毒后菌细胞浓度；

C_L-活体菌细胞浓度，cells/mL；

C_I-受损菌菌细胞浓度，cells/mL；