[发明专利]人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法

说明书

本发明公开了一种人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法，该方法包括如下步骤：针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；对筛选得到的异源抗体进行人源化改造获得人源化IgG单克隆抗体；对筛选得到的人源抗体进行框架优化；需要时后续还可对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟；表达、纯化以获得人源化IgG单克隆抗体标准物质原料；对人源化IgG单克隆抗体标准物质原料进行纯度表征，蛋白质活性表征和结构表征；在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对单克隆抗体标准物质进行定值。

技术领域

本发明涉及IgG抗体检测标准物质技术领域，特别是涉及一种人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法。

背景技术

免疫学检测是临床检测的重要方法之一，它是一种特异性的诊断方法，广泛用于临床检测、确诊和流行病学调查，可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原(如：血清学检测)。免疫学检测方法是利用抗原抗体之间的特异性和可逆空间结合来检测目标物。按检测目标物不同，免疫检测方法主要可分为病毒抗原检测和血清IgM/IgG抗体检测；按检测原理不同，可以分为胶体金法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光法等。免疫学检测作为医院诊疗工作的重要组成部分，为临床诊断和治疗用药等提供依据，免疫学检测的质量对临床诊断结果和治疗效果有最直接的影响。

标准物质(ReferenceMaterial，RM)是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。标准物质是实现检测结果准确、一致、可比的主要工具，也是保证量值有效传递的计量实物标准。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检测技术要求的不断提高，对标准物质的需求和依赖也越来越强烈。血清IgG抗体检测也需要标准物质对检测方法和试剂盒进行质量控制和评价。

然而对于人源的临床标准物质，很多标准物质原料需要从病人血液中提取，这极大限制了临床类标准物质的研制。如果病人难找到、或者血液中含量很低，就需要考虑采用重组蛋白技术体外表达和纯化。针对于难获取原料的血清抗体标准物质的研发，如果不应用重组蛋白技术设计、制备，很难想象有足量一致的、人源提取的血清来源抗体标准物质及时分配、应用于全世界，尤其是应用于像新冠这种突发流行病危机。这也是现有的临床诊断抗体标准物质数目只寥寥数种的原因，一是需要从病人血液提取，原料来源受限；二是针对提取的多克隆抗体的表征、定值难度太大，需要建立可应用于它们的基准定值方法。

具体来说，以急性传染病为例，检测试剂研发周期一般比较短，短时间难以开发研发和生产的标准化流程，难免出现性能高低不一、品质良莠不齐的问题。试剂盒性能评价和质量控制也非常急迫。标准物质作为准确量值的载体，是评价试剂质量的“砝码”，并可以用于检测方法开发与验证，对试剂盒研发和评价进行质量控制和评价等。

现阶段，试剂公司多直接采用阳性血清作为研发的质控品。阳性血清是混合的病人灭活血清，未经过提取纯化，纯度非常低且多克隆来源(因为除了血清基质和抗(病毒)抗原的抗体，还含有极高丰度的不抗(病毒)抗原的本底抗体存在)。它作为质控品的缺陷是具有生物安全风险和批次来源差异，无法精确复制，也无法精确表征，更不用说在其基础上研制纯度、稳定性、均匀性和定值精确性要求极高的标准物质。很多厂家、研发机构无法及时获得阳性血清，在研发过程中只能依靠企业自行研制的物质部分替代质控品的功能，因此研制无生物安全风险、可精确复制、可准确表征与定量的病毒抗体标准物质十分必要。

综上所述，病人血清尤其是未知病毒引发的急性传染病血清中的IgG属于多克隆抗体，不易获取、应用于标准物质制备，难以准备表征、定值。利用单克隆抗体安全、易生产、可复制、能准确表征、可应用基准方法准确定值的特点，可设计、研制病毒单克隆抗体标准物质，用于如传染病中血清抗体的免疫检测方法开发、检测试剂盒质量控制与评价，实验室质量控制，突破目前临床疾病中血清抗体标准物质研制和应用的瓶颈限制。

发明内容