[发明专利]人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法

权利要求书

1.一种人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得2种或2种以上达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；所述抗体库包括正常人天然库、病人抗体库、合成的人源抗体库及免疫动物得到的抗体库，库容量在10⁹以上；所述原型抗体需针对抗原的不同表位；所述亲和力阈值Kd10^-7；

（2）获得人源化的IgG单克隆抗体：

A．如原型抗体来自于病人抗体库、正常人天然抗体库或合成的人源抗体库，则获得的目标抗体已经是人源的，符合制备要求；

B．如原型抗体来自于免疫动物得到的抗体库或非人源合成抗体库，则将原型抗体进行人源化改造获得人源化的IgG单克隆抗体：

1）先利用人天然库对抗体轻链进行链替换，将轻链置换成人源序列；

2）再用CDR移植技术将异源抗体CDR移植入人源IgG框架，对重链进行人源化；

（3）通过细胞培养表达、纯化得到单克隆抗体的标准物质原料：单克隆抗体的标准物质原料的纯度需≥95%；如果纯度95%，则通过不影响抗体活性的方法对单克隆抗体进行纯化，将纯度提高到95%以上；所述不影响抗体活性的方法包括高效凝胶排阻色谱法、亲和色谱法；

（4）对单克隆抗体进行纯度表征；纯度表征方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱法；

（5）对单克隆抗体进行蛋白质活性表征；活性表征方法包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振效价测定法、生物膜层干涉法；

（6）对单克隆抗体进行结构表征，结构表征信息包括单克隆抗体完整分子量测定、切去糖链后完整分子量测定、还原后分子量测定、切去糖链还原后分子量测定、糖基化修饰表征、肽谱表征；确定不同糖型的分布比例；根据单抗的完整分子量和单抗不同糖型修饰的分布比例，计算单抗蛋白的加权分子量；

进行单抗的肽谱分析，将单抗经酶切处理后经质谱仪进行检测，通过软件进行数据库搜索对MS图谱进行处理后得到肽图序列覆盖率；

通过胰蛋白酶、糜蛋白酶的多种酶切方式或者多次质谱分析提高肽谱的序列覆盖率；肽图的序列覆盖率需达到90%以上；

（7）在纯度表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验后，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对该单克隆抗体进行标准物质定值：对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行均匀性检验，采用同位素稀释质谱法进行测定，通过统计学方法分析确定标准物质是否均匀；对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行稳定性检验，稳定性检验包括短期稳定性和长期稳定性，短期稳定性为模拟运输条件下为期一周的稳定性考察，长期稳定性为-70℃储存条件下6个月及以上的稳定性；

以亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对人源化IgG单克隆抗体标准物质进行定值。

2.根据权利要求1所述的人源化IgG单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）A中，对筛选得到的人源抗体进行框架优化，即把CDR移植到高表达的框架上；可选的，对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟；

所述步骤（2）B中，可选的，对获得的人源化IgG单克隆抗体进行体外亲和力成熟。