[发明专利]一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法

说明书

本发明公开了一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，包括步骤一，发酵获取，通过发酵培养→降温离心→抽滤沉淀完成；步骤二，分离纯化，通过离心去液→蛋白复溶→离心去杂→超滤浓缩完成；步骤三，检测含量，包括蛋白含量检测和跑胶酶活检测。本发明利用基因工程链霉菌制备磷脂酶D的发酵方法，为磷脂酶D工业化生产提供了基础方法，为能够保证磷脂酶D制备的酶活性，同时保证磷脂酶D制备的产量，具有良好的科研成果转化基础。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，涉及一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法。

背景技术

近年来，科研人员开始关注酶转化法制备PS，即通过磷脂酶D催化底物磷脂酰胆碱和L-丝氨酸合成；微生物，特别是链霉菌，来源的PS合成磷脂酶酶D(以下简称PLD)具有转磷脂酰的活力，能在水相环境中催化合成PS，反应条件温和、副产物少、产品得率高、质量好，将会成为未来工业化的主要生产方法；但直接从环境中筛选的野生菌催化活性较低，PLD分泌量远低于工业生产标准，严重影响到PLD酶在合成PS产业化的应用。

因此，借助基因工程手段，以链霉菌为生产菌株，通过对产PLD的链霉菌进行构建和改造，筛选出一株高产PLD的基因工程表达菌株，并以这些菌株进行生产导向、高产导向、保持活性等方向的研究，具有重要的研究意义和良好的社会经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优化和改进的链霉菌发酵方法，适应性的用于制备磷脂酶D的基因工程链霉菌，为磷脂酶D工业化生产提供基础方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，发酵获取，具体包括如下步骤：

(1)发酵培养：取活化后的链霉菌孢子接种至MM培养基中，将接种的培养基放置培养箱中，培养至菌液浑浊；

(2)降温离心：将菌液降温到0～4℃，然后使用离心机在4℃条件下离心，再通过倾倒取上清液；

(3)抽滤沉淀：用水系滤膜抽滤上清液去除杂质；收集抽滤过的上清液至干净烧杯；加硫酸铵粉末沉淀蛋白，在4℃条件下放置过夜；

步骤二，分离纯化，具体包括如下步骤：

(1)离心去液：调整离心机转速在4℃条件下离心，弃上清液，保留蛋白沉淀物；

(2)蛋白复溶：将蛋白沉淀物完全溶于PBS缓冲液中，然后转移至1.5mL离心管中；

(3)离心去杂：将复溶后蛋白样品进一步去除沉淀下来的杂质，取蛋白上清液；

(4)超滤浓缩：超滤之前将超滤管用PBS润洗一次，将步骤二(3)中的蛋白上清液加入超滤管中，重复离心，期间加入PBS脱盐，置换蛋白溶剂，得到蛋白浓缩液；

步骤三，检测含量，具体获取蛋白含量和酶活数据；

(1)蛋白含量检测：吸取1-2μL蛋白浓缩液，蛋白检测仪nanodrop one检测总蛋白含量，并以SDS-PAGE胶验证磷脂酶D的表达；

(2)酶活检测，以氯化胆碱做标曲，通过酶联比色法检测磷脂酶D的酶活性。

步骤一中的(1)发酵培养，培养箱设定温度为32℃，培养6天。

所述培养基的凹槽摇瓶中还放置有搅散工具。

所述搅散工具为三角镖结构，其中三个镖腿为等长剪切移液器枪头，而其中心部分为圆形凸起。

步骤一中，所述硫酸铵以430g/L比例进行添加，使得硫酸铵的浓度为65％。