[发明专利]一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法

权利要求书

1.一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，发酵获取，具体包括如下步骤：

(1)发酵培养：取活化后的链霉菌孢子接种至MM培养基中，将接种的培养基放置培养箱中，培养至菌液浑浊；

(2)降温离心：将菌液降温到0～4℃，然后使用离心机在4℃条件下离心，再通过倾倒取上清液；

(3)抽滤沉淀：用水系滤膜抽滤上清液去除杂质；收集抽滤过的上清液至干净烧杯；加硫酸铵粉末沉淀蛋白，在4℃条件下放置过夜；

步骤二，分离纯化，具体包括如下步骤：

(1)离心去液：调整离心机转速在4℃条件下离心，弃上清液，保留蛋白沉淀物；

(2)蛋白复溶：将蛋白沉淀物完全溶于PBS缓冲液中，然后转移至1.5mL离心管中；

(3)离心去杂：将复溶后蛋白样品进一步去除沉淀下来的杂质，取蛋白上清液；

(4)超滤浓缩：超滤之前将超滤管用PBS润洗一次，将步骤二(3)中的蛋白上清液加入超滤管中，重复离心，期间加入PBS脱盐，置换蛋白溶剂，得到蛋白浓缩液；

步骤三，检测含量，具体获取蛋白含量和酶活数据；

(1)蛋白含量检测：吸取1-2μL蛋白浓缩液，用蛋白检测仪nanodrop one检测总蛋白含量，并以SDS-PAGE胶验证磷脂酶D的表达；

(2)酶活检测，以氯化胆碱做标曲，通过酶联比色法检测磷脂酶D的酶活性。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，步骤一中的(1)发酵培养，培养箱设定温度为32℃，培养6天。

3.根据权利要求2所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，所述培养基的凹槽摇瓶中还放置有搅散工具。

4.根据权利要求3所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，所述搅散工具为三角镖结构，其中三个镖腿为等长剪切移液器枪头，而其中心部分为圆形凸起。

5.根据权利要求1所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵以430g/L比例进行添加，使得硫酸铵的浓度为65％。

6.根据权利要求1所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，分离纯化的过程中，应该及时将装有菌液的离心管放入到冰冻保温座进行降温。

7.根据权利要求6所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，所述冰冻保温座包括隔温托盘和金属放置架，其中金属放置架为金属材质的立方体结构，其中顶面向底面凹陷形成若干个试管放置孔，而隔温托盘为泡沫材质，其套设在金属放置架底部，并且其两侧具有方便人端取的把手。

8.根据权利要求1所述的一种利用基因工程链霉菌发酵获取磷脂酶D的制备方法，其特征在于，步骤一中的MM培养基，具体成分包括可溶性淀粉10g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3.4g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 2.34g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，酪蛋白氨基酸5g/L；四种微量金属离子ZnSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、CaCl₂均为0.001g/L，使用的凹槽摇瓶承装。