[发明专利]一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR‑T细胞及其制备方法和应用，所述CAR包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；所述抗原结合结构域为抗FAP单链抗体。本发明采用抗FAP单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，表达所述嵌合抗原受体的T细胞对活化肝星状细胞具有显著的特异性靶向杀伤作用，拓展了细胞免疫疗法的应用范围，为临床治疗肝纤维化和非肿瘤疾病提供了新思路。

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肝纤维化是肝硬化的前期病变，慢性肝病如脂肪肝、肝炎等都会导致肝纤维化，肝纤维化长期积累有可能发展为肝硬化。在肝脏疾病的早期，细胞外基质的生成与降解处于动态平衡过程，肝纤维化形成伴随着纤维化金属蛋白酶(MMP)生成上调并将过量的细胞外基质水解；随着损伤时间的延长，静息肝星状细胞被激活为活化肝星状细胞，快速增殖的活化肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，促进金属蛋白酶组织抑制剂的合成，抑制纤维化金属蛋白酶(MMP)的生成，从而造成纤维溶解受阻、细胞外基质过量沉积和纤维组织异常增生，破坏了肝脏正常组织结构，最终导致肝纤维化。因此从细胞水平看，导致肝纤维化的原因是活化肝星状细胞，而活化肝星状细胞的表面标志物是成纤维细胞活化蛋白(FibroblastActivation Protein，FAP)。

肝纤维化的治疗方式包括药物治疗、手术治疗和干细胞移植治疗，尚无特效的治疗药物或方法能够治愈肝纤维化，目前的临床手段主要通过消除原发病因，减轻病变程度。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T细胞是指表面表达识别特定抗原并向胞内传递信号的嵌合型受体的T细胞，核心是CAR分子携带有特异性识别细胞表面抗原的单链抗体(scFv)，从而识别并杀伤表达特定抗原的细胞。目前，CAR-T细胞疗法主要应用于癌症治疗，在血液瘤和部分实体肿瘤中展现出一定疗效，但是极少用于癌症以外的疾病治疗，鲜有将CAR-T应用于肝纤维化治疗的报道。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的CAR-T细胞及其制备方法和应用，以FAP为靶点设计特异性靶向活化肝星状细胞的CAR载体，构建用于治疗肝纤维化的CAR-T细胞。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种特异性靶向活化肝星状细胞的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；

所述抗原结合结构域为抗FAP单链抗体。

本发明中，采用抗FAP单链抗体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，使得嵌合抗原受体可以特异性结合表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)的活化肝星状细胞，实现对活化肝星状细胞的特异性靶向作用。

优选地，所述铰链区包括CH3。

优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜区。

优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ。

优选地，所述信号传导结构域还包括4-1BB、CD28胞内区、DAP10或OX40中的任意一种或至少两种的组合，优选为4-1BB。

优选地，所述嵌合抗原受体包括抗FAP单链抗体、CH3铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ。

优选地，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：