[发明专利]一种敲除Tim-3基因以延长T细胞体内生存的方法

说明书

本发明涉及一种敲除Tim‑3基因以延长T细胞体内生存的方法，具体涉及一种敲除T细胞TIM‑3基因的方法，包括将CRISPR‑Cas9蛋白和gRNA制成RNP复合体，然后电穿孔方式将RNP复合体输送到T细胞中。本发明方法通过在人类T细胞利用CRISPR‑Cas9和sgRNA特异性敲除HAVCR2基因以延长T细胞生存时间的方法，可以确保实现高效率敲除基因的效果。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是一种基因编辑延长T细胞留存时间的方法，具体可以是通过在人类T细胞利用CRISPR-Cas9和sgRNA特异性敲除HAVCR2基因以延长T细胞生存时间的方法。

背景技术

T细胞的过继免疫疗法(car-T疗法)，全称嵌合抗原受体T细胞治疗技术，是一种新兴的治疗方式，在肿瘤免疫治疗领域展现出广泛地应用。主要是通过体外转导一个识别癌细胞的人工基因于人体T细胞，使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力，再导入患者体内发挥特异性治疗作用。car-T细胞治疗利用人体免疫细胞来对抗肿瘤，具有非常高的针对性，相比于传统化疗具有非治疗靶标细胞杀伤小的优势，被称为“活体药物”。

但car-T疗法普遍存在T细胞衰竭速度较快，体内存留时间短的问题，目前临床通过使用免疫抑制点抗体的方法来增强T细胞抗肿瘤活性。主要是使用PD-1、CTLA-4抗体定向免疫检查点基因敲除，提高car-T疗效，通过封闭相关免疫检查点抗体来激活T细胞的活性，延长体内存留时间。但现有技术对于其他的衰竭信号通路了解有限，其次使用抗体封闭免疫检查点本身存在抗体结合不充分，激活系统免疫的风险。

如果能够通过基因编辑实现T细胞相关靶点敲除，则可以很好地避免使用抗体所在存在的激活系统免疫的风险，所以编辑抗肿瘤T细胞有靶点细胞明确的优势。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在的使用抗体定向免疫检查点基因敲除方法存在效率低、可能激活系统免疫风险的问题，提供一种基因编辑延长T细胞留存时间的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种敲除T细胞TIM-3基因的方法，包括将CRISPR-Cas9蛋白和gRNA制成RNP复合体，然后电穿孔方式将所述RNP复合体输送到T细胞中。

本发明敲除T细胞TIM-3基因方法可以充分发挥CRISPR-Cas9基因编辑技术优势，确保cas9和gRNA高效配合发挥敲除T细胞的TIM-3基因作用，解除免疫抑制，使得抗肿瘤T细胞活性更强，存留时间更长。由于采用电转RNP复合体的方式输送，敲除基因的效果好，敲除率高，获得的T细胞存留时间长，能够很好地解决现有技术中car-T疗法普遍存在T细胞寿命短，衰竭快的问题。本发明所述RNP复合体是核糖核蛋白复合体，是由特定CRISPR-Cas9蛋白与gRNA形成的复合体。

Tim-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3)Cat#Abt-P-422T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，Tim-3)，也称为HAVCR2，为免疫调节分子TIM家族成员，是60kD分子量的I型跨膜糖蛋白。

进一步，所述CRISPR-Cas9蛋白是Cas9重组蛋白。

作为本发明优选方案，所述gRNA是通过基因组数据和生物信息学算法预测，并化学合成和/或修饰的靶向TIM-3基因的RNA片段。

选用的人工序列gRNA具有高结合力和低脱靶率特性，可以显著提高基因敲除效率，能够更好地实现在T细胞中精确基因编辑，使得T细胞治疗产品克服存留时间短的缺陷。

进一步，所述gRNA编码序列包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.37中任意一种。