[发明专利]一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法

说明书

本发明公开了一种基于苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶催化产辛弗林的方法，该方法具体包括以下步骤：生成表达苯乙醇胺‑N‑甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a‑PNMT；培养基因工程菌BL21（DE3）/pET28a‑PNMT和诱导表达PNMT；收集上述菌体，用缓冲液重悬菌体后，匀浆破碎，离心消除杂质，得PNMT的粗酶液；以章鱼胺和S‑腺苷‑蛋氨酸为底物，加入PNMT粗酶液反应得产物辛弗林。本发明方法是首次系统的做出从章鱼胺到辛弗林的酶催化生产工艺，催化效率高达0.5g/l，转化率高达95％以上，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

技术领域

本发明属于辛弗林的制备技术领域，具体涉及一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法。

背景技术

辛弗林主要是从一种水果枳实(Citrus aurantium)中提取出来。已收载于北欧三国药典和德国药典。辛弗林是21世纪天然兴奋剂，无任何副作用和阳性反应，广泛用于医药、食品、饮料等保健行业。随着化学合成药物的禁用，辛弗林的需求量和价值将会倍增。

辛弗林是枳实提取物中的主要活性成分，其可有效预防能量过剩（热量堆积），逐风理气，温胃促进食欲并加速新陈代谢。酸橙理论上可加速脂肪代谢且不会像使用麻黄的患者那样出现不良的副作用影响心血管。其也是一种温和的芬芳除痰剂，一种神经镇定剂和治疗便秘的轻泻剂。据国内外文献报道，辛弗林的化学合成法主要有直接酰化法、氨基乙腈法、乙酐法等，一般选择廉价且常见的苯酚作为起始原料进行合成。由于大自然中含有辛弗林的植物较少，且辛弗林的含量也不高，因此研究辛弗林的生物合成方法是有必要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法，该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，产率高，避免使用对环境或者人体有毒有害的有机试剂，解决化工方法产生的污染问题，环境友好。

一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/ pET28a-PNMT

根据已报导的人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶（PNMT）的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-PNMT，将构建好的重组质粒pET28a- PNMT用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到苯乙醇胺-N-甲基转移酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a- PNMT；

步骤2，培养PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT

挑取表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.75mM的IPTG，25℃培养10-12小时，离心收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT；

步骤3，收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT，用pH2-9的缓冲液重悬后，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得PNMT粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤4，选取章鱼胺及SAM作为底物，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至2-9，最后加入PNMT粗酶液0.5-20g/l，20-60℃反应0.5h-24h，得到产物辛弗林。

作为改进的是，步骤2中所述产酶条件为：加入IPTG的量为0.75mM、诱导温度为25℃。

作为改进的是，步骤4中所述的催化条件为：温度50℃、pH=5；所述章鱼胺：SAM的摩尔比为1:4。

有益效果：