[发明专利]一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法在审
| 申请号： | 202110254866.5 | 申请日： | 2021-03-09 |
| 公开（公告）号： | CN112899297A | 公开（公告）日： | 2021-06-04 |
| 发明（设计）人： | 陈可泉;程莎莎;王昕;冯娇;许晟;张阿磊;欧阳平凯 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/54;C12N9/10;C12P13/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 南京擎天知识产权代理事务所(普通合伙) 32465 | 代理人： | 涂春春 |
| 地址： | 210000 江苏省南京市*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 乙醇胺 甲基转移酶 催化 产辛弗林 方法 | ||
1.一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，构建表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/ pET28a-PNMT
根据已报导的人源苯乙醇胺-N-甲基转移酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-PNMT，将构建好的重组质粒pET28a- PNMT用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到苯乙醇胺-N-甲基转移酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a- PNMT；
步骤2，培养PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT
挑取表达PNMT的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃培养10-18小时，离心收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT；
步骤3，收集表达苯乙醇胺-N-甲基转移酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-PNMT，用pH2-9的缓冲液重悬后，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得PNMT粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；
步骤4，选取章鱼胺及S-腺苷-蛋氨酸作为底物，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至2-9，最后加入PNMT粗酶液0.5-20g/l，20-60℃反应0.5h-24h，得到产物辛弗林。
2.根据权利要求1所述的一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法，其特征在于，步骤2中所述产酶条件为：加入IPTG的量为0.75mM、诱导温度为25℃。
3.根据权利要求1所述的一种基于苯乙醇胺-N-甲基转移酶催化产辛弗林的方法，其特征在于，步骤4中所述的催化条件为：温度50℃、pH=5；所述章鱼胺：SAM的摩尔比为1:4。
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