[发明专利]一种促进DNT细胞扩增与活化的方法

权利要求书

1.一种促进DNT细胞扩增与活化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、制备肿瘤细胞膜抗原粗液；

(2)、肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞培养；

(3)、肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞外囊泡制备；

(4)、利用肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞外囊泡促进DNT细胞扩增与活化。

2.如权利要求1所述的一种促进DNT细胞扩增与活化的方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：

(11)、对于来自外科手术或活检瘤组织，用生理盐水清洗2～3次后，在无菌条件下用灭菌的剪刀和镊子剔除脂肪、筋膜和大血管，称重后用手术剪刀将肿瘤组织切成1～5立方毫米的小块后，放入无菌的组织研磨器中，加入1～5倍肿瘤组织重量/体积的预冷细胞裂解液，将组织研磨器置于冰水浴中进行肿瘤组织的研磨和均质，得到组织均浆，其中：

肿瘤组织的重量以克计；

预冷细胞裂解液以毫升计；

(12)、将步骤(11)所得的组织匀浆经300～500目无菌细胞筛网过滤，滤液收集在无菌离心管中，滤渣置于研磨器中加入1～3倍肿瘤组织重量/体积的预冷细胞裂解液再次进行研磨，再经300～500目细胞筛网过滤，用1～3倍肿瘤组织重量/体积预冷细胞裂解液淋洗研磨器，并经筛网滤入离心管中得到肿瘤组织裂解液，其中：

肿瘤组织的重量以克计；

预冷细胞裂解液以毫升计；

(13)、将步骤(12)所得盛放有肿瘤组织裂解液的离心管连续冷冻融化2～3次，完成后将该离心管置于离心机中以500～1000转/分钟离心10～15分钟，收集上清液，其中：

冷冻融化的条件为：将盛放有肿瘤组织裂解液的离心管置于-80℃～-60℃条件下冷冻存储8～24小时后，转移到4℃～9℃条件下融解18～48小时；

(14)、在步骤(13)所得的上清液中，按重量/体积0.5％～2％的比例加入脱氧胆酸钠离子去污剂,然后在1～8℃的条件下连续搅拌1～3小时后，40000～100000转/分钟离心20～60分钟，吸去表层的油脂后，收集提取液，无菌密封后置-80℃～-60℃冰箱中保存，得到肿瘤细胞膜抗原粗液。

3.如权利要求2所述的一种促进DNT细胞扩增与活化的方法，其特征在于，步骤(11)中的外科手术或活检瘤组织取材时避免用退变组织。

4.如权利要求2所述的一种促进DNT细胞扩增与活化的方法，其特征在于，步骤(11)中的细胞裂解液的制备包括以下步骤：

(111)配置含有0.05％～0.2％苯甲基磺酰氯、0.1％～0.6％氯化钠的水溶液；

(112)经115～125℃灭菌30～60分钟后，预冷至1～5℃存放即可。

5.如权利要求1所述的一种促进DNT细胞扩增与活化的方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：

S11、将采集的胸腹水经200～400目无菌细胞筛网过滤，分装在称过重量的刻度离心管中，用2500～3500转/分钟的转速离心10-30分钟，弃上清并称重计算沉淀物重量后，在沉淀物中加入3～10倍重量/体积的预冷细胞裂解液，用吸管吹打混合均匀，其中：

胸腹水的沉淀物以克计；

预冷细胞裂解液以毫升计；

S12、将步骤S11的离心管密封后置冰水浴中孵育10-30分钟，用组织匀浆器以2500～3500转/分钟的转速上下匀浆粉碎4～8次后，然后反复冻融三次使滤液中的细胞完全裂解得到细胞冻融液，其中：冻融包括以下步骤：

将离心管放入-80℃～-60℃冰箱中冻存8～24小时，取出后置4℃～9℃水浴中融解18～48小时；

S13、将步骤S12所得的细胞冻融液分装在高速离心管中，在1～5℃以500～1000转/分钟的转速离心10-15分钟，吸取上层液体分装在已确定重量的高速离心管中，按重量/体积0.5％～2％的比例加入脱氧胆酸钠离子去污剂,在1℃～8℃的条件下连续搅拌1～3小时后，以20000～50000转/分钟的转速离心20～60分钟，吸去表层的油脂和上清液，收集沉淀物，无菌密封后置-80℃～-60℃冰箱中保存，得到肿瘤细胞膜抗原粗液。