[发明专利]一种促进DNT细胞扩增与活化的方法

说明书

本发明公开了一种促进DNT细胞扩增与活化的方法，包括：(1)制备肿瘤细胞膜抗原粗液；(2)肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞培养；(3)肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞外囊泡制备；(4)利用肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞外囊泡促进DNT细胞扩增与活化。本发明具有以下有益效果：1、利用肿瘤细胞膜碎片来提供肿瘤细胞膜抗原；2、利用肿瘤细胞膜抗原粗液来激活DC细胞，制备肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞及其外分泌囊泡，使其特异性地呈递多种肿瘤细胞膜抗原；3、利用肿瘤细胞膜抗原负载DC细胞外分泌囊泡呈递的多种肿瘤抗原，进一步刺激DNT细胞的增殖和活化，提升DNT细胞的杀瘤作用和特异性。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及免疫细胞培养，具体涉及一种促进DNT细胞扩增与活化的方法。

背景技术

双阴性T(Double Negative T，DNT)细胞是指人外周血中正常存在的CD3+CD4-CD8-的T细胞亚群，占T细胞总数1-5％。过去，DNT细胞被视为一种调节性T细胞，过继转移DNT细胞可以防止同种异体移植物排斥反应、移植物抗宿主病和自身免疫性糖尿病。后来，科学家逐渐发现DNT细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用。

JB·李(lee JB)等研究表明健康志愿者来源的同种异体DNT细胞可以靶向急性髓细胞白血病(Acute Myelocytic Leukemia，AML)细胞，与传统化疗有着协同的抗肿瘤作用。KJ·杨(Young KJ)等将淋巴瘤细胞与主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，MHC)Ⅰ类分子不匹配的脾细胞一同注入小鼠，发现超过75％的小鼠幸存下来，幸存小鼠与罹患淋巴瘤小鼠相比，外周血中DNT细胞增加了15倍。接下来的实验证明DNT细胞对A20淋巴瘤细胞具有杀伤作用，初步证明了DNT细胞的抗肿瘤作用。S·沃尔克在淋巴瘤患者和外周血中分离出一群DNT细胞，它们可以特异性识别淋巴瘤相关抗原GP100，对于表达GP100的靶细胞和HLA-A2+GP100淋巴瘤细胞具有细胞毒作用。有学者发现体外扩增的γδ+DNT细胞对肺癌细胞具有杀伤作用。最新研究表明DNT细胞对肺癌和白血病患者标本来源的异种移植肿瘤模型有显著的抗肿瘤作用，并且输注同种异体的DNT细胞不会诱发移植物抗宿主病。

DNT细胞表面表达CD3分子和αβ-或γδ-T细胞受体(T Cell Receptor，TCR)，但不表达CD4和CD8分子，也不结合恒定型自然杀伤T(invariant Nature Killer T，iNKT)细胞特异性αGalCer加载的CD1d四聚物，因此不同于常规的T细胞、NK细胞和NKT细胞，DNT细胞具有NK细胞不具备的T细胞受体TCR活性，能为特异性抗原活化，具有更长的体内持续时间，是一种极有希望用于治疗临床多种肿瘤的通用型T细胞药物。

树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞。DC细胞能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。成熟DC细胞可有效的诱导抗原特异性T细胞增殖和活化，是机体抗肿瘤免疫反应的主要启动者和参与者。

DNT细胞表面表达TCR受体能识别主要组织相容性复合体分子，还能够以非肿瘤抗原限制性的方式杀伤肿瘤细胞，同时防止同种异体移植物排斥反应、移植物抗宿主反应，这为采用DNT细胞治疗肿瘤开辟了一条新途径。

传统的DNT细胞培养方法大多依靠CD3抗体和CD28抗体等来模拟抗原呈递过程刺激单个核细胞向DNT细胞转化、增殖和活化，不具备抗原特异性。本发明将DNT细胞与DC细胞联合培养，通过DC细胞以主要组织相容性抗原与肿瘤抗原复合体的形式呈递抗原，特异性地促进了DNT细胞的增殖和活化。模拟了从特异辨别肿瘤细胞到消灭肿瘤细胞的全过程，即利用肿瘤细胞抗原来激活DC细胞，使其特异性地吞噬和呈递多种肿瘤抗原，进一步刺激DNT细胞的增殖和活化，提升DNT细胞的杀瘤作用。

发明内容