[发明专利]HMGB1在评估非小细胞肺癌病情和临床疗效方面的应用

权利要求书

1.一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的生物学标志物，其特征在于，所述生物学标志物为HMGB1。

2.一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的试剂盒，其特征在于，包括用于采集血浆的3.2％枸橼酸钠抗凝管、用于实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测的Trizol^TM试剂、逆转录试剂盒、HMGB1正向及反向引物、GAPDH正向及反向引物、用于Westernblot方法检测的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液、10％聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜、5％脱脂奶粉、兔抗人HMGB1单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、用于酶联免疫吸附试验的人HMGB1 ELISA试剂盒、样品稀释液、POD-溶剂、底物溶液、终止液。

3.根据权利要求2所述的一种用于评估非小细胞肺癌病情和临床疗效的试剂盒，其特征在于，所述底物溶液包括A液和B液。

4.一种使用权利要求2的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织和血浆标本收集；(2)qRT-PCR方法检测肺癌组织和癌旁组织的HMGB1 mRNA水平；(3)Western blot方法检测肺癌组织和癌旁组织的HMGB1蛋白水平：(4)ELISA方法检测血浆HMGB1水平。

5.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(1)组织和血浆标本收集，具体包括以下过程：

(1-1)NSCLC患者手术后，收集肺癌肿瘤组织和癌旁组织距离癌组织边缘5cm，且病理证实为正常肺组织；-80℃保存；

(1-2)采集肘静脉血3mL，置于3.2％枸橼酸钠抗凝管内，混匀后4℃，2500g离心10分钟；保留血浆，-80℃保存。

6.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(2)实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HMGB1 mRNA水平，具体包括以下过程：

(2-1)Trizol^TM试剂提取肺癌组织和癌旁组织的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作；将2μg总RNA 逆转录为cDNA；

HMGB1引物正向序列：5’-TCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGT-3’；

HMGB1引物反向序列：5’-CTGCTTGTCATCTGCAGCAGTGTT-3’；

GAPDH引物正向序列：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’；

GAPDH引物反向序列：5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’；

(2-2)SYBR Green混合液5μL、cDNA 0.5μL、HMGB1正向及反向引物各0.2μL、GAPDH正向及反向引物各0.2μL和4.1μL不含核酸酶的水组成总体积10μL的聚合酶链式反应；反应条件为：95℃10min一次循环初始变性，95℃15s变性40次循环，60℃30s退火，72℃30s延伸；GAPDH作为内参，2^-ΔΔCT方法计算基因表达水平；HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1mRNA的相对表达量。

7.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(3)Western blot方法检测HMGB1蛋白水平，具体包括以下过程：

(3-1)肺癌组织和癌旁组织在含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中4℃裂解30分钟，12000g离心10min；

(3-2)10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离10μg总蛋白，在恒电流200mA下，转膜120min；

(3-3)PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，兔抗人HMGB1单克隆抗体(1:10000)，4℃摇床过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1:10000)，室温摇床孵育1h；

(3-4)采用增强的化学发光法进行检测；GAPDH作为内参，ImageJ图像软件分析，HMGB1/GAPDH比值表示HMGB1蛋白的相对表达量。

8.根据权利要求4所述的试剂盒进行非小细胞肺癌病情和临床疗效的评估方法，其特征在于，所述步骤(4)ELISA方法检测血浆HMGB1水平，具体包括以下过程：

(4-1)按照人HMGB1 ELISA试剂盒说明书操作，酶标板的每个孔中先加入100μL样品稀释液，再加入标准品和血浆样品10μL，37℃水浴24h；

(4-2)洗涤后每孔加入100μL POD-溶剂，室温2h；

(4-3)洗涤后每孔加入100μL底物溶液，100μL底物溶液包括50μL A液+50μL B液，室温避光孵育30min；

(4-4)加入100μL终止液，多功能酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。