[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA‑125a的小鼠模型及构建方法。本发明利用CRISPR/Cas9技术，在C57BL/6J小鼠基因组中实现了包括pre‑miRNA‑125a在内的一段外源DNA片段的定点敲入，在纯合敲入小鼠中miRNA‑125a表达量显著升高。本发明提供了一种精确、高效、简便的定点敲入miRNA‑125a的办法，可用于miRNA‑125a功能研究的小鼠模型，对实现其它miRNAs的定点敲入亦有参考价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法。

背景技术

基因的定点修饰技术是研究基因功能的重要手段之一，继早期的基因打靶后，目前研究者共发现了三代人工核酸内切酶。第三代人工核酸内切酶Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)因其操作简便、成本低廉、作用高效而得到了广泛应用[1]。其中，又以CRISPR/Cas9为迄今应用最广泛的基因编辑工具，它由crRNA和tracrRNA嵌合在一起的一条RNA链——sgRNA(singleguide RNA)和Cas9蛋白两部分组成。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，包括RuvC和HNH两个活性中心，在sgRNA的指导下可以分别切割DNA的一条链，最终造成DNA双链断裂(DSB)[2]。

利用CRISPR/Cas9系统造成DSB后，如同时提供一段携带同源臂的供体(Donor)DNA，因生物体内本身有同源重组能力，可将这段外来序列定点插入至断裂位置[3]。

CRISPR/Cas9系统在被应用于定点敲入时，需要提供一段每个末端都存在同源臂(Homology Arm,HA)的供体DNA，以便封闭切割所造成的断裂。有研究者利用携带GFP的Donor DNA转染HEK293T细胞，研究同源臂的长度与编辑成功率的关系。结果表明，长度为33～38nt的同源臂与长度为518nt的同源臂的编辑成功率是相同的，均为10％～20％；而同源臂缩短至15～16nt后，成功率下降了一半；与此同时，Donor DNA(不含同源臂)的长度在57～993nt之间时，编辑成功率在10％～50％，长度越短编辑成功率越高；超过1000nt后，成功率会降至0.5％左右[4]。

miRNA是一类长约22nt，具有广泛生物活性的ncRNA。成熟的miRNA主要通过与靶基因3’UTR上的靶点进行碱基互补配对实现对靶基因的表达调控，当它与靶点完全互补时，RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)会使mRNA发生降解；而当miRNA与靶点序列不完全互补时，RISC则能对mRNA的翻译起到抑制作用[5,6]。哺乳动物中，大多数编码蛋白质的mRNA都会受到miRNA的调控。已有研究显示miRNAs与早期妊娠密切相关。

miRNA-125a是一种在进化上高度保守的miRNA，在多种组织中都有表达，在细胞分化、个体发育等过程中发挥着重要调控作用[7]。研究已证实，miRNA-125a与生殖密切相关，有研究者发现，miRNA-125a在大鼠胚胎植入中存在差异表达[8]；此外，在pri-miRNA-125a编码基因中有两个SNPs，此外，在两个SNPs下游有一突变位点，该突变与这两个SNP共存能够增加复发性流产(RSA)的发生风险[9]。

近交系是指一个动物群中，任何个体基因组中99％以上的等位位点为纯合；C57BL/6J小鼠是一种常见的近交系，以57号母鼠和52号公鼠交配为起源，因其遗传背景清晰，被广泛应用于遗传学研究中。

总的来讲，相较编码基因而言，目前基于CRISPR/Cas9技术实现miRNAs定点敲入的研究较少；特别地，并未有基于CRISPR/Cas9技术定点敲入miRNA-125a的C57BL/6J小鼠的构建方法的相关报道。

参考文献