[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9技术构建的C57BL/6J模型小鼠，其特征在于，该模型小鼠为pre-miRNA-125a敲入小鼠；优选的，敲入序列为pre-miRNA-125a的全部，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

2.建立miRNA-125a敲入小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对C57BL/6J小鼠的pre-miRNA-125a，选择敲入位点，设计sgRNA，donor DNA；

(2)采用CRISPR/Cas9基因编辑方法合成sgRNA、donor DNA与Cas9，并进行注射，获得F0代小鼠；

(3)将阳性F0代小鼠和野生型C57BL/6J交配、繁育，最终得到具有miRNA-125a敲入阳性纯合小鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，敲入位点选择Spaca6基因第一内含子中不编码任何信息且人与小鼠比对后的差异区域。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述donor DNA包括以sgRNA切割位点为中心上下游各约1kb的同源臂，以及一段敲入序列；优选的，所述敲入序列包括：pre-miRNA-125a的全部，以及其上游的侧翼序列；优选的，所述侧翼序列为pre-miRNA-125a上游205bp、下游223bp的序列；优选的，敲入序列包括小鼠基因组中pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括分别构建sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；合成携带一对同源臂的donor DNA；并将体外转录的sgRNA、donor DNA与Cas9蛋白共同进行原核注射，注射后的受精卵植入母鼠子宫获得F0。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，纯化小鼠时，F0先与野生型交配，得到F1，F1再与野生型交配得到碱基序列相同的F2，同窝F2互相交配可得到纯合敲入的F3；优选的，阳性F1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

8.一种鉴定miRNA-125a敲入小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)剪取少量小鼠组织，提取基因组DNA；

(2)针对权利要求3中所述的敲入位点设计一对PCR扩增引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：12～13所示；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证。

9.一种对miRNA-125a敲入小鼠进行脱靶验证的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对权利要求3中所述的一条sgRNA，选择三个预测概率较大的潜在脱靶位点，每个潜在脱靶位点设计一对PCR扩增引物；

(2)阳性纯合敲入及野生对照F3小鼠，剪取组织提取基因组DNA；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证。

10.权利要求1所述的模型小鼠在生殖及妊娠相关疾病研究中的应用。