[发明专利]将诱导多能干细胞定向分化为内耳毛细胞样细胞的方法

说明书

本发明提供一种将诱导多能干细胞定向分化为内耳毛细胞样细胞的方法。主要是利用化学成分明确的培养基，适时添加小分子化合物将iPSC诱导分化为内耳祖细胞，再经鸡胚椭圆囊细胞与内耳祖细胞共培养，从而获得内耳毛细胞样细胞。本发明所述方法能够有效地将诱导多能干细胞定向分化为内耳毛细胞样细胞，分化获得的内耳毛细胞样细胞具有纤毛毛束结构，表达内耳毛细胞特异蛋白，具有毛细胞电生理功能。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种将诱导多能干细胞定向分化为内耳毛细胞样细胞的方法。

背景技术

听力损伤是全球重大的公共卫生问题，据世界卫生组织2019年估计，全球约有4.6亿人有听力障碍(http://www.who.int/en/)。内耳毛细胞是人类听力系统中国一类重要的感觉上皮细胞，通过机械-电转换的方式将内耳感受的声波转换为电刺激，并沿听神经传导至大脑，形成听觉。通常认为，哺乳动物内耳毛细胞损伤后很难再生，因此内耳毛细胞损伤是人类听力损伤的重要原因。近年来研究提示一定的实验条件下，哺乳动物内耳毛细胞可以实现部分再生。2013年，Edge团队研究发现利用Notch通路抑制剂后能够使得噪音创伤小鼠产生新的内耳毛细胞，听力也得到了部分恢复(Mizutari K,Fujioka M,Hosoya M,Bramhall N,Okano HJ,Okano H,Edge AS.Notch inhibition induces cochlear haircell regeneration and recovery of hearing after acoustic trauma.Neuron.2013；77(1):58-69.)。2019年，Chen团队发现激活Myc和Notch1能够有效地实现成年小鼠耳蜗感觉上皮细胞的增殖，且支持细胞能够响应转录因子Atoh1，转分化为毛细胞样细胞(Shu Y,Li W,Huang M,Quan YZ,Scheffer D,Tian C,Tao Y,Liu X,Hochedlinger K,Indzhykulian AA,Wang Z,Li H,Chen ZY.Renewed proliferation in adult mousecochlea and regeneration of hair cells.Nat Commun.2019；10(1):5530.)。不过，在体条件下内耳毛细胞再生的效率和安全性方面仍存在很大挑战。

2006年Yamanaka和Takahashi通过成功利用小鼠细胞获得诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)，iPSC具有与胚胎干细胞(embryonic stemcell，ESC)相似的细胞特征，如表达干性标志基因、具有三胚层分化潜能等(Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors.Cell.2006；126(4):663-76.)。通过iPSC定向分化为多种组织细胞，可以从组织特异性的角度进行细胞命运决定、器官发育、再生等领域开展研究，具有相当的临床应用前景。目前，全世界的科学家已经在多种模式动物和人类中成功将胚胎成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、血液细胞、尿液细胞等各种类型的细胞重编程为iPSC(Theunissen TW,Jaenisch R.Molecular control of induced pluripotency.CellStem Cell.2014；14(6):720-34.)。这极大地拓展了可用于再生医学研究和治疗可用的细胞种类，因此利用iPSC在体外定向分化为内耳毛细胞样细胞，将为内耳毛细胞命运决定分子机制，内耳毛细胞再生药物筛选，细胞再生治疗等领域的研究提供重要的细胞来源，具有重要研究和应用价值。

发明内容

本发明目的是提供一种将诱导多能干细胞定向分化为内耳毛细胞样细胞的方法，通过以下步骤实现：

(1)将iPSC接种至Laminin包被的培养板，使用内耳祖细胞培养基培养10-12天；