[发明专利]一种检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH的近红外荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种检测NADH的近红外荧光探针及其应用，所述荧光探针以BODIPY为荧光母体，喹啉鎓作为NADH的还原位点，探针与NADH反应之后，由于存在较强的分子内电荷转移(ICT)，最大吸收波长红移至725nm，在760nm处发射较强的荧光信号，不易受到生物基质和杂质的干扰。本发明提供的荧光探针具有较高的检测灵敏度，且BODIPY母核具有较低的细胞毒性和较好的生物相容性，可广泛的用于细胞和生物组织中NADH的检测。

技术领域

本发明涉及近红外荧光探针及制备方法和应用，特别涉及具备检测NADH的近红外荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术

在许多生物催化过程中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其磷酸酯(NADPH)分别作为还原型辅酶Ⅰ和还原型辅酶Ⅱ有着广泛的应用。受糖酵解、三羧酸循环和线粒体呼吸的影响，NAD(P)H在能量代谢中起着至关重要的作用，是线粒体中能量产生链中的控制标志物。监视NAD(P)H的氧化还原状态是表征活体内线粒体功能的最佳参数。

NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ。N指烟酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸。NADH在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。NADH产生于糖酵解和细胞呼吸作用中的柠檬酸循环，并作为生物氢的载体和电子供体，在线粒体内膜上通过氧化磷酸化过程，转移能量供给ATP合成，所以NADH又被称为线粒体素。NADH分子是线粒体中能量产生链中的控制标志物。

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。有研究表明AD患者神经元细胞线粒体内NADH含量明显低于非AD患者。因此，检测NADH的近红外荧光探针用来进一步研究AD的发病进程具有广阔的应用前景。

近红外荧光探针作为NADH检测的主要手段之一，在细胞及活体内NADH检测中发挥着重要作用。常见的传统检测NADH方法有紫外分光光度法、电化学分析法、毛细管电泳法、色谱法、酶循环法等。与这些传统NADH检测方法(只能体外检测、信号弱、背景高等)相比，近红外荧光探针检测方法的灵敏度高，对活细胞无毒性，稳定性好，反应快，使用方便，更具有优势。因而构建、研发可识别检测NADH的近红外荧光探针是目前NADH检测的研究热点。

发明内容

为克服上述现有技术中的缺点，本发明目的是提供一种具备检测NADH的近红外荧光探针及其制备方法和应用。

本发明通过以下技术方案实现发明目的：

本发明的第一个目的是提供一种实时检测NADH的近红外荧光探针，该探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

进一步的，式(Ⅰ)所示近红外荧光探针以硼二吡咯甲烷(BODIPY，CAS:947328-71-4)为荧光母体，喹啉鎓作为NADH的还原位点。

探针与NADH反应之后，由于存在较强的分子内电荷转移(ICT)，最大吸收波长移至715nm，并在760nm处发射较强的荧光信号。

为达到上述目的，本发明采用如下反应步骤：

本发明的第二个目的是提供一种制备前述检测NADH的近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

a：取式(Ⅱ)所示化合物1和3-喹啉甲醛置于装有迪安-斯达克分水器的圆底烧瓶中，并用乙腈和哌啶的混合溶液溶解，在对甲基苯磺酸(p-TsOH)的催化下，80℃回流30分钟，得到固体产物；

所述化合物1与3-喹啉甲醛物质的量的比为1:2；所述混合溶液中，乙腈和哌啶的体积比为50:1，所述化合物1在混合溶液中的浓度为5～6mg/mL。