[发明专利]一种检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH的近红外荧光探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种实时检测NADH的近红外荧光探针，其特征在于，该探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述的检测NADH的近红外荧光探针，其特征在于：所述近红外荧光探针以硼二吡咯甲烷为荧光母体，喹啉鎓作为NADH的还原位点。

3.一种制备权利要求1所述检测NADH的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a：取式(Ⅱ)所示化合物1和3-喹啉甲醛置于装有迪安-斯达克分水器的圆底烧瓶中，并用乙腈和哌啶的混合溶液溶解，在对甲基苯磺酸的催化下，80℃回流30分钟，得到固体产物；

所述化合物1与3-喹啉甲醛物质的量的比为1:2；所述混合溶液中，乙腈和哌啶的体积比为50:1，所述化合物1在混合溶液中的浓度为5～6mg/mL；

将所得固体产物溶解在二氯甲烷中，用水洗涤；将洗涤所得有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸发溶剂，所得残渣经硅胶柱层析纯化，再由二元溶剂重结晶得到式(Ⅲ)所示化合物2，所述二元溶剂为二氯甲烷/正己烷；所述化合物1和化合物2结构式如下：

b：将化合物2和碘甲烷加入到三氯甲烷中，得到混合物，所述化合物2在三氯甲烷中的浓度为20mg/mL，所述碘甲烷与三氯甲烷体积比为1:100；

室温下，将混合物在氮气保护下搅拌24小时，减压蒸发溶剂，所得残渣加入二氯甲烷得到新的沉淀，即为式(Ⅰ)所示检测NADH的近红外荧光探针。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：a中所述洗涤次数为3次。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：a所二元溶剂二氯甲烷与正己烷的体积比为1：8。

6.权利要求1所述的近红外荧光探针在检测NADH中的应用，其特征在于：所述近红外荧光探针与NADH反应之前，在652nm处有荧光发射；在与NADH反应之后，会在700～760nm处产生新的荧光，为OFF-ON型荧光反应。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述近红外荧光探针与NADH反应之前，荧光光谱仪检测中，所述荧光探针的激发波长为595nm，发射波长为652nm；与NADH反应之后，产物的激发波长为715nm，发射波长为760nm。

8.根据权利要求6所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针的线性范围为0.1μM～15μM的NADH，检测限为0.20μM的NADH。

9.根据权利要求6所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

S1、取所述近红外荧光探针，溶于乙腈，充分混匀，使其完全溶解，配制探针储备液，放于4℃冰箱备用；

S2、制备待测样品；所述待测样品为NADH溶液；

待测样品制备方法为：取NADH，溶于PBS缓冲液，配制NADH溶液；

S3、将S1得到的探针储备液和S2得到的待测样品，以及吐温溶液混合，再用PBS缓冲液定容，所述PBS缓冲液pH＝5～8，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为100μM，吐温溶液的体积比为0.05％，进行反应，所述反应温度为37℃，反应时间为60～90分钟；

S4、采用荧光分光光度计进行荧光测试，当反应体系在激发波长为715nm，发射波长为760nm，表示待测样品中包含NADH。

10.根据权利要求9所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S1所述探针储备液中，近红外荧光探针的浓度为2×10^-3M。

11.根据权利要求9所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S3所述反应PBS缓冲液pH＝7.4，反应时间为60分钟。