[发明专利]基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的MUC1蛋白定量检测方法

说明书

本发明公开了一种基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的MUC1蛋白定量检测方法，包括的步骤是：从被测对象的血清中提取外泌体；用抗体捕获外泌体，使用细胞膜荧光染料对其进行染色；加入荧光染料标记的MUC1蛋白适配体，孵育后与外泌体膜上的乳腺癌标志MUC1蛋白结合；通过激光全内反射荧光显微镜观察外泌体和适配体的共定位，并进一步采用单分子荧光漂白技术对乳腺癌标志蛋白进行定量检测。本发明方法操作简单、成本低、灵敏度高、特异性高，适合实验室常规开展检测。将本发明检测结果得到的MUC1表达量与健康人血清中单个外泌体MUC1蛋白表达量进行对比，从而对被检测对象是否患有乳腺癌进行辅助评估。

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种人体外泌体MUC1蛋白定量检测方法。

背景技术

乳腺癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤之一，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势，已成为当前社会的重大公共卫生问题。部分女性死于这种疾病，主要原因为肿瘤的早期转移、药物耐药、肿瘤复发等。因此，乳腺癌的早期诊断对改善患者无复发生存率和提高无病生存率至关重要。

目前，超声、全数字化X线乳腺钼靶、磁共振成像等影像学检查广泛应用于乳腺癌的筛查，但这些技术均局限于对较大的肿瘤的检测。临床上另一种常规检测方法为病理检查，对从病人体内取出的活体组织进行染色观察，通过细胞的形态和结构判断是否出现癌变。但这种方法不仅存在取样位置局限给检测结果造成极大的偏差，还因为其侵入性给患者带来极大痛苦。对乳腺癌的筛查和治疗监控还可以通过检测血清学肿瘤标志物和分子生物标志物，但因存在灵敏度低、特异性差等问题，不能及时筛选出早期乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞。因此，研发一种简单高效、无创性、成本低和灵敏度高、特异性强的检测技术以实现对乳腺癌的早期快速诊断尤其重要。近些年来发展的液体活检技术通过体外无创抽血的方式获取肿瘤脱落在血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体(Exosome)，以此来实现对癌症的早期筛查和动态监测。而与前两者存在来源不确定、检出率低、特异性差等缺点相比，外泌体在癌症的早期诊断中成为更有希望的靶点。

外泌体是一种能被机体内大多数细胞在正常及病理状态下均可分泌的脂质双层膜囊泡，直径大约30-150nm，普遍存在于唾液、血清、尿液、眼泪和其他体液中。外泌体中富含核酸、蛋白、胆固醇等，在细胞通讯中起着重要作用。肿瘤来源的外泌体可以转移肿瘤基因的内容物，调节受体细胞的基因表达，从而在肿瘤的发生、发展、转移以及耐药中发挥关键作用。此外，外泌体在其表面携带多种肿瘤特异性蛋白，其蛋白水平通常与疾病状况有关，可以预测亲代肿瘤的起源。乳腺癌特异性表达的蛋白有MUC1、HER2、EpCAM和CEA等，其中，MUC1蛋白的表达水平能反映乳腺癌的某些生物学特征，与乳腺癌的发生、转移、预后等关系密切。MUC1蛋白在乳腺癌组织中出现质和量的异常表达，因此成为十分重要的癌标志物。外泌体作为一种新的生物标志物，可用于乳腺癌的特异性检测。特别是外泌体表面蛋白的评估对肿瘤的诊断和预后具有重要的研究意义。

为了分析整个外泌体生物信息，需要采用分子传感器来区分源自癌症的外泌体和正常细胞之间的细微差异。目前，常规的外泌体检测主要采用免疫印迹法、酶联免疫吸附法、电化学传感、微流体传感等方法。但这些方法存在成本高、样品量多、程序复杂、灵敏度低等局限性。而荧光检测具有低毒性、成本低、多样性以及灵敏度高等优点。荧光分子被广泛用于抗体标记和DNA探针标记，便于通过抗原/抗体相互作用和核酸杂交来检测外泌体。荧光传感一般都对大量的分子进行测量。通常情况下，很难注意到这些信号的细微变化，这大大限制了这些方法的灵敏度。而单分子检测技术可以在单个荧光分子成像的基础上连续观察溶液中荧光分子的强度变化。通过单分子荧光漂白技术(SMP)可以实现对荧光分子的定量检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MUC1蛋白定量检测方法，是基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术定量检测人类外泌体表面MUC1蛋白的方法，该方法可以解决现有技术中操作复杂、成本高、灵敏度低、特异性低等问题。