[发明专利]基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的MUC1蛋白定量检测方法

权利要求书

1.一种基于外泌体检测和单分子荧光漂白技术的MUC1蛋白定量检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

(1)从血清中提取外泌体

a.用1×磷酸盐缓冲液稀释血清，依次以800×g离心力离心5min、2000×g离心力离心10min和10000×g离心力离心30min，以去除完整的细胞和细胞碎片；

b.取上清液，并用0.22μm孔径的过滤器过滤，将过滤后的上清液以100000×g离心力离心2h，去上清，将底部沉淀重悬于1×磷酸盐缓冲液中，以100000×g离心力离心2h，所得沉淀为外泌体；将该外泌体重悬于1×磷酸盐缓冲液中，并在-80℃下保存备用；

(2)用抗体捕获外泌体，使用细胞膜荧光染料对其进行染色

a.在羧酸功能化玻片的通道中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺混合物，室温孵育2h；

b.用滤纸引流出并加入抗CD81抗体，室温孵育2h；用滤纸引流出，加入含5％牛血清白蛋白的pH7.0的磷酸盐缓冲液PBS，室温孵育2h后用1×磷酸盐缓冲液冲洗3次；

c.加入步骤(1)提取的外泌体样品，室温孵育1h，用1×磷酸盐缓冲液冲洗3次；

d.加入荧光染料DiO，室温孵育10min，使染料和外泌体膜囊泡反应；然后用1×磷酸盐缓冲液冲洗3次；

(3)加入荧光染料Cy3标记的MUC1蛋白适配体序列，室温孵育1h，用1×磷酸盐缓冲液冲洗3次，MUC1蛋白适配体序列与外泌体膜上的MUC1蛋白结合，得到待测样品；

(4)通过激光全内反射荧光显微镜观察外泌体和适配体的共定位，并进一步采用单分子荧光漂白技术对MUC1蛋白进行定量检测

a.分别用荧光染料DiO和荧光染料Cy3的激发波长的光激发待测样品，然后在全内反射荧光显微镜下观察荧光染料DiO和荧光染料Cy3荧光分子发光，分别得到DiO通道和Cy3通道中的荧光图像，并记录Cy3通道中的单分子光漂白过程；

b.单个外泌体中MUC1蛋白表达量的确定：通过全内反射荧光显微镜Cy3通道观察荧光分子漂白总步数，从而确定外泌体表面MUC1蛋白的表达量；通过全内反射荧光显微镜DiO通道中的图像计算出外泌体数目；计算外泌体表面MUC1蛋白的表达量和外泌体数目的比值，得到单个外泌体表面MUC1蛋白表达量。

2.根据权利要求1所述的MUC1蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中的所有离心过程均为差速超速离心法，并在4℃完成。

3.根据权利要求1所述的MUC1蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述抗体为抗CD81抗体，CD81蛋白是外泌体跨膜蛋白，在各种细胞来源的外泌体表面广泛且高表达。

4.根据权利要求1所述的MUC1蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，荧光染料DiO为发绿色荧光的DiO，其激发波长为473nm，荧光发射在501nm。

5.根据权利要求1所述的MUC1蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中，荧光染料Cy3为发橙色荧光的Cy3，其激发波长为532nm，荧光发射在568nm。

6.根据权利要求1所述方法在定量检测外泌体表面MUC1蛋白表达中的应用。