[发明专利]蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法

说明书

本发明提供一种蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法。使用蛋白质组学分析平台，和超高效液相色谱串联飞行时间质谱，基于TQMS仪器分析，得到同时具备高易酶解性与高酶解后稳定性的候选MRJPs多肽。生物标记物包括：MRJP1的特异性标志多肽：YNGVPSSLNVISK，SEQ ID NO：1；MRJP2的特异性标志多肽：TLQMIAGMK，SEQ ID NO：2；MRJP 3的特异性标志多肽：LTVAGESFTVK，SEQ ID NO：3。本发明具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于体现蜂王浆整体生物活性的新鲜度检测，尤其适用于蜂王浆原料和产品质量控制。该方法对规范蜂王浆质量评价，尤其是未来蜂王浆主蛋白产品市场的开拓，蜂王浆产业的健康发展具有重要现实意义。

技术领域

本发明涉及蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法。

背景技术

蜂王浆和蜂蜜是两种深受欢迎的蜂产品。蜂王浆，又称王浆和蜂乳，是由5~15日龄工蜂头部营养腺（包括脑后腺、咽下腺和上颚腺等）分泌的特殊白色乳状物质。蜂王浆是蜂王和3日龄内工蜂幼虫的专用食料，是决定蜜蜂雌性幼虫发育成为蜂王还是工蜂的关键食物因素。作为一种营养保健品，蜂王浆的活性和功能很多，显然其功能与其所含的生物活性成分有关，已知其主要成分包括蛋白质、碳水化合物、脂类和王浆酸等。近年来相关研究表明，蜂王浆中的主要生物活性在常温下会随储存时间下降，极易变质而失去营养功能。迄今为止十羟基葵烯酸（王浆酸，10-HDA）含量是目前我国和国际蜂王浆标准中衡量品质优劣的主要指标（GB 9697-2008 蜂王浆）。然而研究显示，在长期储存过程中，蜂王浆中的10-HDA含量非常稳定，并不适合作为代表蜂王浆新鲜度的指标[Antinelli J F， Zeggane S， Renée Davico， et al. Evaluation of (E)-10-hydroxydec-2-enoic acid as a freshnessparameter for royal jelly[J]. Food Chemistry， 2003， 80(1):85-89]，因此亟需完善的蜂王浆质量评价体系。

蛋白质是蜂王浆中的主要活性物质，占王浆干重的30~50%，其中由9个成员（MRJP1~9）组成的糖基化蛋白家族—王浆主蛋白（Major royal jelly proteins，缩写MRJPs）占王浆中可溶性蛋白含量的90%左右。在常温下储存过程中，由于蜂王浆中内源性酶等的作用，蛋白质随会随着储存时间的推移而降解，引起蛋白质结构的改变和含量的下降。现有蜂王浆新鲜检测技术主要是由沈立荣团队研发的，基于对单一蜂王浆主蛋白成员——王浆主蛋白1（MRJP 1）特异性蛋白标志物MRJP 1含量进行检测的聚丙烯酰胺电泳法（SDS-PAGE）和间接酶联免疫测定法（ELISA）[Shen Li-rong et al. Determination of royal jellyfreshness by ELISA with a highly specific anti-apalbumin 1， major royal jellyprotein 1 antibody[J]. Journal of Zhejiang University-SCIENCE B， 2015， 16(2):155-166]，并申请发明专利-电泳胶蛋白条带检测蜂王浆新鲜度的建立方法和应用（申请号: 201410554252.9）。这些方法能通过蜂王浆中MRJP 1随时间的降解程度分析，对蜂王浆的新鲜度做出快速判断。然而，由于ELISA法的开发需要利用动物制备特异性抗体，周期长，成本高且重现性不高；而SDS-PAGE法的只能根据电泳图像的蛋白条带灰度作初步的含量差别判断，特异性较低，定量能力差，均不适合作为标准化的精准定性定量分析方法。近年来，胡菡等制备了利用王浆主蛋白3-MRJP3为抗原的单克隆抗体，申报了可检测MRJP3含量的酶标仪（ELISA）快速检测方法及试剂盒（胡菡，李建科，冯毛，房宇，韩宾. 抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒. 2018年，CN107892713A）。