[发明专利]蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法

权利要求书

1.一种蜂王浆新鲜度的生物标记物的筛选方法，其特征在于：

1）预处理：将蜂王浆样品经DTT、IAA溶液预处理后，用重组牛胰蛋白酶酶解，得到王浆主蛋白（Major royal jelly proteins, MRJPs）的多肽溶液；

2）数据分析：使用ProteinLynx Global Server（PLGS）蛋白质组学分析平台，将经超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）检测出的MRJPs多肽序列信息与从UniProt蛋白质数据库（www.uniprot.org）获取的MRJPs多肽序列理论信息比对分析，得到王浆粗蛋白酶解产物中MRJPs多肽的鉴别结果；将经UPLC-Q-TOF/MS质谱分析得到MRJPs多肽参数导入超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-TQMS）仪器中，建立候选多肽的定量MRM分析方法，经检测得到69条候选多肽；

3）特征多肽筛选：基于TQMS仪器分析，对69条候选多肽作重复检测，初步剔除35条峰面积低于2000的低含量多肽；

建立MRJPs候选多肽的酶解时间与酶解程度的热力分析图，进一步筛选出同时具备高易酶解性与高酶解后稳定性的候选MRJPs多肽；高易酶解性多肽的标准是候选多肽的相对峰面积比值能在酶解2 h内达到90％以上，高酶解后多肽稳定性的标准是候选多肽的相对峰面积比值在酶解24 h后不小于70％；剔除候选多肽中的非特异性多肽，得到15条MRJPs候选多肽；

基于2小时最佳酶解时间和高响应值，从15条候选多肽中分别筛选出1条MRJP1、MRJP2、MRJP 3的最佳候选多肽：

MRJP1的特异性标志多肽：YNGVPSSLNVISK，SEQ ID NO：1；

MRJP2的特异性标志多肽：TLQMIAGMK，SEQ ID NO：2；

MRJP 3的特异性标志多肽：LTVAGESFTVK，SEQ ID NO：3。

2. 基于蛋白质组学的蜂王浆新鲜度生物标记物，其特征在于，为以下特异性标志多肽的一条或多条的组合：MRJP1的特异性标志多肽：YNGVPSSLNVISK，SEQ ID NO：1；MRJP2的特异性标志多肽：TLQMIAGMK，SEQ ID NO：2；MRJP 3的特异性标志多肽：LTVAGESFTVK，SEQ IDNO：3。

3.如权利要求2所述的生物标记物，其特征在于，采用同位素标记的肽段YNGVPSSL^*NVISK、TL^*QMIAGMK和L^*TVAGESFTVK作为内标，其中^*为定量离子，L^*为同位素标记[¹³C₆，¹⁵N]-亮氨酸。

4.如权利要求3所述的生物标记物，其特征在于，采用液相色谱串联质谱检测法（LC-MS）量分别检测蜂王浆样品中的MRJP~3的含量，YNGVPSSLNVISK在10-1600 ng/mL范围内具有良好线性关系，TLQMIAGMK和LTVAGESFTVK在10-600 ng/mL的范围内具有良好线性关系，相关系数R² 0.99。