[发明专利]人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法

说明书

本发明涉及干细胞技术领域，更具体的，是一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法。包括对人脐带间充质干细胞冻存方法、复苏方法，以及跟踪记录平台，通过冻存及复苏实现对脐带间充质干细胞的保存，从采集到运输、从检测到培养、从冻存到复苏的各个过程中，对每一个过程都就行严格的质量监控，并形成环环相扣的、唯一对应的记录，确保干细胞样本的唯一性和可追溯性。也可为研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，建立人脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据的重要基础。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，更具体的，是一种人脐带间充质干 细胞的冻存及复苏方法。

背景技术

脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在 于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，脐带间充质干细胞 (MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、 软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具 有广阔的临床应用前景。

应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培 养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临 床应用提供了理论依据。

从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓 MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争 议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。

脐带间充质干细胞能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑 狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥 反应，提高细胞或器官移植的成功率；能促进造血恢复功能，与单一 造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高 白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；能修复损伤或病变的组织器 官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓 神经损伤和老年痴呆等。

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存 的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种 的作用。细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及 各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代 培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和 体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分 必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在 液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。利用冻存技术将 细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他 意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以 利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻 存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％.15％的甘油或二甲基亚砜 (DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分 透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

细胞复苏是与细胞冻存相反的过程，即是细胞恢复生长的过程， 是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养。当恢复 到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。与细 胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细 胞，形成冰晶，影响细胞存活。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大 限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护 剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞 内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形 成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证 细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细 胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

发明内容