[发明专利]人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法

权利要求书

1.一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，其冻存方法，包括步骤：

D1细胞室及工作台紫外线照射20～30min；培养液、冻存液、9％氯化钠注射液、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱40℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天换液；

配制含10％DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液；准备9％氯化钠注射液、胰蛋白酶、DMSO；

D2取预冻存细胞，去除旧培养液，用9％氯化钠注射液清洗；

D3去除9％氯化钠注射液，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；

D4加入培养基终止消化，吹打使细胞悬浮，转移至离心管中，取样计数，离心，1200rpm，10min；

D5去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

D6将细胞分装入冻存管中，每管1～2.5ml；

D7控制冷冻速度，保存标准时，将其冻存管移入液氮容器内保存；

D8在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，D7步骤中将装有细胞的冻存管放入4℃药品保存箱预冷10-30min，程序降温盒中，在低温样本转移车的保护下，转移至-80℃超低温药品保存箱，保存4-72小时，转移至气相液氮储存罐；或，

D7步骤中将装有细胞的冻存管放入4℃药品保存箱预冷10-30min，放入-20℃药品保存箱0.5-1h，然后放入-70℃药品保存箱中8-16h，取出冻存管，移入液氮容器内；或，

D7步骤中冻存温度控制方式为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，转移至气相液氮储存罐。

3.根据权利要求2所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，D2步骤中预冻存细胞可为从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞，优选对数生长期细胞。

4.根据权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，细胞在冻存前24小时内更换一次培养液。

5.根据权利要求2中任一项所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，其复苏方法，包括步骤：

S1从液氮容器中取出冻存管，直接浸入40℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；

S2从40℃恒温水浴锅中取出冻存管，迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒并晾干；

S3用吸管吸出细胞悬液，加4℃预冷的氯化钠注射液，重悬混匀；

S4离心，1200rpm，8min；

S5弃去上清液，把细胞转入含有10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度；

S6接种培养瓶，然后把培养瓶移至培养箱，36℃～38℃培养72h±24h；

S7更换新鲜培养基，增殖至所需数量，收获细胞；

S8详细记录复苏细胞的名称、数量、复苏时间、存放部位。

6.根据权利要求5中任一项所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，在步骤S1中，解冻冻存管过程中盖上恒温水浴锅的盖；40℃恒温水浴锅中融化，冻存管细胞融化时间为1-3min，融化后移出40℃水浴。

7.根据权利要求6中任一项所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，步骤S3中用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀在4℃生物安全柜中进行操作。