[发明专利]一种制备胰腺beta细胞的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种制备分化的胰腺beta细胞的方法及其应用，具体的，所述方法包括如下步骤：(1)多能干细胞的三维悬浮驯化培养；(2)诱导驯化后的细胞分化为胰腺beta细胞。本发明还涉及由所述的分化的胰腺beta细胞制备海藻酸钠‑聚赖氨酸‑海藻酸钠(APA)微囊化的人工胰岛的方法，所述方法为：使用海藻酸钠溶液制备微囊化的人工胰岛。本发明还涉及所述的胰腺beta细胞及人工胰岛的应用。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种制备胰腺beta细胞的方法及其应用。

背景技术

糖尿病是胰岛功能减退或衰竭而导致机体糖代谢紊乱的疾病。根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)的最新统计，2019年，全球超过4.63亿人患有糖尿病，到2045年将有7亿人患糖尿病；中国以1.16亿人糖尿病患者位居世界第一，到2045年预计将达到1.47亿人。2019年，全球约有420万人(20-79岁)死于糖尿病或其并发症，每6秒就有1人死于糖尿病，约占全球全死因死亡的11.3％。

1型糖尿病占糖尿病总数的5-10％，是由beta细胞数量和功能的完全丧失引起的。目前治疗手段主要是胰岛素长期注射治疗和胰岛移植，胰岛素注射在根本上无法治愈糖尿病及并发症；新型的胰岛素泵也有携带不方便、血糖控制不稳定和给病人带来很多痛苦的劣势。另外，胰岛移植策略中胰岛的提取与纯化过程非常复杂，器官资源的匮乏以及如何高效稳定地获得能满足临床移植要求的胰岛也是胰岛移植的主要挑战。针对以上问题，开发干细胞治疗技术，用以重新恢复体内原本缺失的胰腺beta细胞是根治糖尿病的更好选择(Pagliuca FW等，2013)。

目前有关干细胞分化为beta细胞的方法主要包括：(1)基因转染方法，是将控制胚胎向胰腺发育的多个转录因子PDX-1，NKX6.1，Ngn3，NeuroD，Pax4等转染至细胞中，使其诱导分化为胰岛素分泌细胞(Noguchi H等，2006)。然而，基因转染方法存在潜在致癌风险，它是利用病毒载体将外源基因插入细胞基因组中，可能会使抑癌基因失活。除此之外，该方法获得的胰岛素分泌细胞并不成熟，不能够很好的对葡萄糖的刺激做出响应。(2)细胞因子诱导法，该方法是根据胚胎向胰腺的发育过程，在体外模拟胰腺发育中的关键步骤，将干细胞诱导分化为胰腺beta细胞或胰腺祖细胞(Pagliuca FW等，2014；Rezania A等，2014；KroonE等，2008)。然而该方法步骤复杂，分化时间较长；而且不成熟的分化方法容易带来分化批次稳定性较差，细胞得率较低，规模化生产受限等问题。但开发出成熟稳定的细胞因子诱导分化方法是能够很好的攻克以上问题的，这也可以在体外获得稳定的、规模化的、成熟的功能性胰腺beta细胞。

另外，移植成熟的胰腺beta细胞至异体环境中，往往会受到异体的免疫排斥，进而使得移植的beta细胞丧失原有的功能。目前有关异体移植过程中解决免疫排斥问题的主要策略是联合免疫抑制剂的使用，但免疫抑制效果往往不太理想且面临着终生服药的痛苦。最新的策略显示开发安全有效的免疫隔离工具成为异体移植过程中解决免疫排斥问题的更好选择(Omid Veiseh等，2015；Arturo J Vegas等，2016；Daniel G Anderson等，2016)。免疫隔离工具中所用包裹材料的选择是移植成功的关键，由于受不同包裹材料的影响，分化所得到的beta细胞体内功能评价效果差异也比较明显。目前常用的包裹材料包括：(1)天然材料。脂质、多糖和蛋白质；(2)半合成材料。纤维素类衍生物等；(3)合成材料。包括可降解性和非降解性材料。其中许多材料移植体内会出现严重的纤维化包裹、无免疫隔离功能等问题，严重影响到包裹细胞的活性和功能。然而，开发出一种理想的包裹材料便可以解决上述异种移植过程中存在的问题。

因此，多能干细胞衍生的胰腺beta细胞有望通过细胞替代策略治疗糖尿病，但如何更好地规模化稳定的在体外获得成熟的胰腺beta细胞并且解决异体来源胰腺beta细胞移植后出现的免疫排斥问题一直是研究热点。

发明内容