[发明专利]一种制备胰腺beta细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种多能干细胞三维悬浮定向分化为成熟胰腺beta细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)多能干细胞的三维悬浮驯化培养；

(2)诱导驯化后的细胞分化为胰腺beta细胞；

所述的多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的多能干细胞的三维悬浮驯化培养的步骤包括：

1)Y27632预处理，优选的，在悬浮培养前2小时将平面培养的多能干细胞进行换液，更换为含10μM浓度的Y27632的mTeSR1培养基；

2)使用DMEM/F12培养基清洗中和预处理细胞；

3)在mTeSR1+Y27632培养基中震荡培养所述多能干细胞，优选的，在mTeSR1+Y27632培养基中传代5-10次，每天更换一半培养基，传代时去除培养上清中的单细胞和聚集的大细胞团块，优选的，所述去除大细胞团块为使用400μm筛网过滤去除大于400μm的细胞团块；

更优选的，所述的多能干细胞的接种密度为3-8*10⁵/mL，三维搅拌培养的参数为：50-120rpm转速、恒温37℃、5％CO2、100％湿度，所述培养基为含10μM浓度的Y27632的mTeSR1培养基；

4)检测驯化后的多能干细胞，细胞呈球状悬浮生长且Oct4+/SSEA4+双阳细胞比例在95％以上即为驯化合格。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的诱导驯化后的细胞分化和微囊化的步骤包括：

使用步骤(1)驯化的多能干细胞作为分化的起始种子细胞，分化步骤为：

1)mTeSR1培养基(含10μM Y27632)中接种0.3-0.7*10⁶个散开的三维悬浮驯化的多能干细胞，培养24-72小时后，更换首日培养基，换液时体积减少10-20％，

首日培养基为：S1培养基中添加：50-200ng/ml重组人激活素A(Activin A)、10-100ng/mL重组人Wnt3a蛋白；

2)第2日更换第2日培养基；

第2日培养基为：S1培养基中添加：50-200ng/ml Activin A；

3)第4～6日更换第4日培养基；

第4日培养基为：S2培养基中添加：20-100ng/ml重组人角化细胞生长因子蛋白(KGF)、1-5μM转化生长因子-βRI激酶抑制剂IV(TGF-βRI Kinase Inhibitor IV)；

4)第7～8日更换第7日培养基；

第7日培养基为：S3/S4培养基中添加：20-100ng/ml KGF、0.1-0.5μM Sant1、1-5μM视黄酸(RA)、100-500nM 1,1,4,4-四苯基-1,3-丁二烯(TPB)、5-20μM Y27632；

5)第9～13日更换第9日培养基；

第9日培养基为：S3/S4培养基中添加：20-100ng/ml KGF、0.1-0.5μM Sant1、50-200nMRA、10-100ng/mL EGF、10-100ng/mL重组人头蛋白(NOG)、5-20μM Y27632；

6)第14～16日更换第14日培养基；

第14日培养基为：S5培养基中添加：0.1-0.5μM Sant1、50-200nM RA、0.5-2μMγ-分泌酶抑制剂XXI(γ-Secretase Inhibitor，XXI)、5-20μM RepSox、0.5-2μM三典甲状腺氨酸(L-3,3',5-Triiodothyronine,T3)、5-50ng/ml重组人β细胞素(Recombinant HumanBetacellulin Protein)、50-500nM LDN193189盐酸盐(LDN193189 hydrochloride)、10μM硫酸锌；

7)第18～20日更换第18日培养基；

第18日培养基为：S5培养基中添加：10-50nM RA、0.5-2μM XXI、5-20μM RepSox、0.5-2μM T3、5-50ng/ml Betacellulin、50-500nM LDN193189、1mM N-cys(Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH)；

8)第21天时，将分化细胞消化为单细胞并重新接种于反应器中再培养，培养过程中将重聚集的正常细胞团收集，弃去未聚团的上清，即得分化的胰腺beta细胞；

优选的，所述再培养的参数为：50-120rpm转速，恒温37℃，5％CO₂和100％湿度，21-35天时，每两天更换一次S3培养基，使用10-50μm可逆滤器收集将重聚集的正常细胞团；

所述的各个培养基成分为：

S1培养基：MCDB131基础培养基+1:10000-100000胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)+1-5mM谷氨酰胺，必要的缓冲盐(NaHCO₃)、抗生素、抗氧化剂(VC)、葡萄糖及血清白蛋白；

S2培养基：MCDB131基础培养基+ITS-X 1:10000-1:100000+1-5mM谷氨酰胺，必要的缓冲盐(NaHCO₃)、抗生素、抗氧化剂(VC)、葡萄糖及血清白蛋白；

S3/S4培养基：MCDB131基础培养基+ITS-X 1:50-1:500+1-5mM谷氨酰胺，必要的缓冲盐(NaHCO₃)、抗生素、抗氧化剂(VC)、葡萄糖及血清白蛋白；

S5培养基：MCDB131基础培养基+ITS-X 1:50-1:500+1-5mM谷氨酰胺+2-20μg/mL肝素钠盐，必要的缓冲盐(NaHCO₃)、抗生素、抗氧化剂(VC)、葡萄糖及血清白蛋白。