[发明专利]一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法。将含有用海洋微拟球藻密码子优化的Cas9失活蛋白、表观遗传修饰效应蛋白M3M14和靶基因引导序列的载体导入微拟球藻获得突变体，突变株经培养后实现对靶基因的表观基因组编辑，从而定向提高靶基因的转录水平。本发明为海洋微拟球藻基因表观遗传调控功能研究和表观维度的遗传改良提供了一种新的模型和可行性方法，将为其它模式藻株的分子育种提供借鉴。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法。

背景技术

海洋微拟球藻是一种单细胞真核光合微藻，广泛分布于海洋、湖泊、沼泽等不同栖息水域。它们富含叶绿素a、类胡萝卜素、虾青素等光合色素、蛋白质和多不饱和脂肪酸，并且生长迅速。由于其具有较高的油脂含量、较好的环境适应性及适于烟道气培养等特性，在微藻生物燃料、微藻膳食补充剂、水产养殖饲料等产业备受青睐，是“蓝色粮仓”的重要生物资源之一。随着近些年合成生物学的兴起，微拟球藻已经发展为重要的合成生物学光合底盘细胞之一。近些年来，在国内外不同团队的努力下，微拟球藻中相继建立了较完善遗传操作工具。如基于电转化或基因枪等遗传转化方法在几株微拟球藻(N.oceanica IMET1，N.oceanica CCMP1779，N.oceanica CCMP526，N.oceanica CCMP526等)代表种也基本已经建立，正反向遗传学工具如随机插入突变、过表达、RNAi技术和同源重组的方法在不同种(如N.salina)里面也有报道。另外，基因编辑技术在几株代表物种(如N.salina)也已经建立，如基于episome的无选择压力基因编辑等。同时，在不同的微拟球藻藻株也开展了基于转录组和蛋白质组的研究，发现了一系列调控光合固碳、油脂合成代谢的调控靶点，那么遗传工具在验证基因功能和代谢途径改造方面就有了用武之地。然而，基因的表达调控是受多方面制约的，除了受mRNA和蛋白质本身调控，DNA、RNA和蛋白质上面的化学修饰在调控基因表达方面也发挥着重要作用，这就是表观遗传修饰调控。另外，微拟球藻中存在众多的表观遗传相关的酶(如甲基化或去甲基化、乙酰化或去乙酰化等)，并且这些酶在不同胁迫条件下呈现差异表达，推测它们在基因表达调控中起着关键作用。因此，怎样从表观遗传修饰层面调控基因表达也是亟待解决的重要课题。

近几年来CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛使用使得很多以前很难完成的实验想法得以轻松完成，充分显示了Cas9的强大威力。也许基因组范围的基因编辑大家很熟悉，但是近一年来有关表观基因组的基因编辑方兴未艾，目前世界上很多实验室在开始在这个方向进行努力突破。从表观遗传修饰角度进行调控基因表达，在哺乳动物和植物体系目前都已有所开展，尤其是在哺乳动物研究体系，相继开发了以P300为代表的靶向乙酰化修饰(以CRISPR/dCas9为基础，dCas9-P300结合到靶DNA增强子或启动子上，促进组蛋白H3K27发生乙酰化，从而导致基因激活)调控基因表达。此方法可重塑靶区域的表观遗传修饰，进而激活或抑制增强子及其靶基因的转录活性。与其他方法相比，此技术不仅表现出了更稳定的增强子激活或抑制效应，同时还显示了其靶向的高特异性。众所周知，DNA甲基化是表观遗传学领域中最重要的研究方向之一。但是如何在特定区域实现精准的DNA甲基化编辑，长期以来都是一个难以解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋微拟球藻靶向表观基因遗传调控方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法，将含有经海洋微拟球藻密码子优化Cas9失活蛋白、表观遗传修饰效应蛋白M3M14和靶基因引导序列的载体导入微拟球藻获得突变体，突变株经培养后实现对靶基因的表观基因组编辑，从而定向提高靶基因的转录水平。

所述载体以微拟球藻用Cas9表达载体(pNOC-ARS-CRISPR)作为骨架，包含Cas9失活蛋白(即dCas9)、表观遗传修饰效应蛋白M3M14、抗性选择标记基因、至少一个gRNA靶基因引导序列和增强表观遗传修饰的特异序列(SunTag序列)。