[发明专利]一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法，通过将甲醇、乙腈、异丙醇与内标准品工作液混合制成内标溶液，并在内标溶液中添加乙酸铵，从而简单高效地完成样品前处理，无需任何额外的样品富集等操作，即可显著提高血清样品中维生素A、E、K1、K2的回收率，并使经过前处理后的样品更加稳定，大幅提高血清中脂溶性维生素的检测灵敏度；而且配置的内标溶液非常稳定，可长期保存，随用随取，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。同时本发明还提供了乙酸铵用于制备内标溶液的用途。

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

维生素A(VA)又称视黄醇，具有维持正常视觉、维护上皮组织、促进骨骼正常生长发育的功能。人体内VA不足会导致干眼病、夜盲症和皮肤过度角化等营养缺乏症。25-羟基维生素D是调节人体钙磷代谢的重要因子，协调骨钙的动员或沉积、尿钙的吸收或排泄，维持体内血钙水平的稳定，对骨骼发育塑形、肌肉神经传导效应及细胞活动、信息传递等生命活动至关重要。儿童缺乏表现为佝偻病，成人缺乏表现为骨软化、骨质疏松；过量会引起钙的吸收增加，导致高钙血症。维生素E(VE)是一组以立体异构体存在的生育酚类物质，其中以α-生育酚活性最强。VE能促进性激素分泌，提高男性和女性的生育能力，能防止自由基或氧化剂对细胞膜的损伤，具有预防动脉粥样硬化、心血管系统疾病和更年期综合症的生理作用，VE缺乏时会出现睾丸萎缩和上皮细胞变性，致孕育异常。维生素K主要的生理作用是参与凝血酶原及凝血因子的合成，人体缺乏VK会导致凝血时间延长，严重者有出血倾向，在某些因素的影响下(如感染、腹泻等)甚至有颅内出血的风险，其中维生素K1是肝脏合成因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ所必须的物质，在临床上应用于凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症的防治以及梗阻性黄疸、胆瘘、慢性腹泻等所致出血，香豆素类、水杨酸钠等所致的低凝血酶原血症；维生素K2是维生素K唯一具有生物活性的形式，多用于加速凝血、维持凝血时间、治疗维生素K缺乏引起的出血症，也有用于其他保健途径的报道。因此，脂溶性维生素的检测可评估患者体内的脂溶性维生素的营养状况。对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。

目前国内外有关血清中脂溶性维生素的测定方法报道很多，常见的方法有：层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法，在众多的方法中，液相色谱法或液相串联质谱法为测定脂溶性维生素的首选方法，以往方法存在操作过程复杂、干扰因素多、特异性差、分析时间长、灵敏度不高、定性定量准确性差且重现性较差的问题，这主要都是因为样品前处理过程繁琐、回收率不高、稳定性差所造成的。

现有的脂溶性维生素样品前处理方法主要是采用液液提取(如CN106504947A)和固液萃取方法(如CN110763788A)，需经稀释、多次萃取、旋转蒸发、氮气吹干、净化等多个步骤，过程繁琐，需大量的人工操作，而且液液提取难以实现高通量和自动化，固液萃取虽然能实现高通量，但其中样品萃取过程主要依靠SLE板来完成，耗材成本高。

目前也有不少采用蛋白沉淀法进行血清和血浆中脂溶性维生素样品测定的样品前处理的相关专利申请，如CN111999397A、CN110487943B等，但普遍存在回收率不高而导致灵敏度偏低的问题，有些甚至在蛋白沉淀后，还需要进一步萃取，才能进行后续的检测分析，使临床检测需要更多的人工操作，不利于临床的推广和使用。

因此迫切需要一种操作简单、处理效率高、回收率高、成本低、人工工作量小等优点的脂溶性维生素样品前处理方法，使其可以克服现有方法的以上不足和缺陷，从而使高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的方法具备更高的灵敏度，检测过程更加简便高效，并能保证检测结果的准确性和稳定性。

发明内容